超聲輔助提取花生紅衣中原花青素

黃武，李亞杰，亢帥，蒲云峰，侯旭杰*，郭芹，王強*

（1.塔里木大學生命科學學院，南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

花生紅衣是花生精深加工過程中的副產物，產量較大，除用作動物飼料以外，在其他加工領域未得到有效利用。經研究發現，花生紅衣中主要成分有水分（5%～9%）、蛋白質（11%～18%）、脂肪（10%～14%）、粗纖維（37%～42%）、碳水化合物（12%～28%）、灰分（8%～12%）、單寧（7%）以及多種色素和硒、鋅、鈣、鉀、鐵等元素[1-2]。花生紅衣中多酚類物質含量為90 mg/g～125 mg/g，包括白藜蘆醇、原花青素、酚酸等物質[3-4]，其中原花青素是在熱、酸條件下能產生花色素的一種無色物質。原花青素是一種很強的抗氧化物質，它在人體內的抗氧化能力是維生素C的20倍，維生素E的50倍，可用作安全無毒的新型天然抗氧化劑[7-8]。若能充分利用花生紅衣中的原花青素，將會獲得較可觀的經濟效益[9]。

利用超聲波、微波破碎植物細胞壁，可有效提升植物中功效成分的提取效率[10-12]。尤其是超聲輔助提取技術在植物有效成分提取中有較為廣泛的應用，在花生紅衣的活性成分提取方面也有相應的研究，王菲等[13]、陳洋[14]、童愈元[15]、管文荻[16]用超聲輔助提取花生紅衣中原花青素；林櫻姬等[17]、任虹等[18]用超聲輔助技術對花生紅衣中多酚進行提取，并取得較好的結果，證明此技術適用于花生紅衣活性成分的提取。因此，本研究在超聲輔助提取的基礎上，結合水浴浸提以提高提取效果，并用正交試驗優化原花青素的提取工藝，為花生紅衣這一副產物的高值化開發利用提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣：產地為山東，品種為四粒紅；無水乙醇、甲醇：天津市北聯精細化學品開發有限公司；香草醛（純度≥99%）：天津市科密歐化學試劑有限公司；4%香草醛-甲醇溶液：精確稱取4.00 g香草醛用甲醇溶解并在100 mL容量瓶中定容；鹽酸：四川西隴化工有限公司；原花青素標準品（純度≥98%）：合肥博美生物公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

水浴恒溫振蕩器（SHA-B）：江蘇金怡儀器科技有限公司；旋轉蒸發器（RE-3000A）：上海亞榮生化儀器廠；數控超聲波清洗器（SB-5200DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；循環水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：鄭州長城科工貿有限公司；微型旋渦混合儀（WH-3）：上海滬西分析儀器廠有限公司；數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋（EMS-20）：金壇市科順儀器廠；電子天平（LE203E/02）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高速冷凍離心機（TGL-20br）：上海安亭科學儀器廠；紫外可見光分光光度計（UV-2450）：島津公司。

1.3 方法

1.3.1 花生紅衣中原花青素的提取方法

稱取干燥花生紅衣粉碎成粉末狀。用適量石油醚對紅衣粉末進行脫脂：常溫下浸泡24 h，間歇攪拌，抽濾、烘干，得到花生紅衣脫脂粉末。精確稱取1.0 g脫脂后的花生紅衣粉末與乙醇溶液（體積分數40%～80%）按比例[1∶20（g/mL）～1∶60（g/mL）]混合，在 30 ℃～70 ℃下超聲處理10 min～50 min。參考王菲等[13]的方法，將超聲處理后的樣液轉入30℃～70℃水浴浸提30 min～70 min。然后將得到的溶液在4 000 r/min條件下離心10min，將上層澄清液取出，用無水甲醇定容至100mL。從中吸取1 mL樣液，用無水甲醇定容至10 mL，得到原花青素樣品待測液[19-22]。數據均為3次平行試驗所得平均值。

1.3.2 原花青素提取率的測定

1.3.2.1 原花青素的測定方法

鹽酸-香草醛法測定原花青素：準確吸取3 mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL濃鹽酸于試管中，再吸取樣品液0.5 mL，迅速混勻，在避光條件下進行20 min顯色反應，測定吸光度[23]。

1.3.2.2 原花青素最大吸收波長的確定

精確稱取原花青素標準品配制成濃度為0.1mg/mL標準溶液，按照鹽酸-香草醛法的條件反應后，在紫外可見分光光度計下進行光譜掃描，選擇最大吸收波長。

1.3.2.3 標準曲線的繪制

精確稱取50 mg原花青素標準品，用無水甲醇于50 mL容量瓶定容，得到1 mg/mL的標準液，之后分別稀釋成 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL（注：如由 1 mg/mL得到0.1 mg/mL稀釋液，取1 mL 1 mg/mL標準液，再加入9 mL無水甲醇）這5個梯度，準確量取0.5 mL各梯度標準品溶液，分別加入含3 mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL濃鹽酸的混合液中，快速混勻，避光條件下反應20 min，于500 nm波長下測定吸光度，空白對照為無水甲醇，繪制標準曲線。

1.3.2.4 原花青素提取率的計算

適當稀釋原花青素提取液，按照1.3.2.1中方法測定吸光度。根據標準曲線函數計算出樣品中原花青素的質量濃度（mg/mL），按照公式（1）計算出原花青素的提取率。

式中：C為原花青素質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數；m為花生紅衣粉末質量，g。

1.4 正交試驗優化花生紅衣中原花青素提取工藝

在單因素試驗的基礎上，對料液比、乙醇體積分數、超聲溫度、超聲時間進行四因素三水平正交試驗，選擇最佳工藝，因素水平如表1所示。

表1 正交試驗L9（34）因素水平Table 1 Factor and levels of the orthogonal experiment L9（34）

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長選擇

在紫外可見分光光度計下進行光譜掃描，原花青素最大吸收波長光譜圖見圖1。

圖1 原花青素最大吸收波長光譜圖Fig.1 Spectrogram of the maximum absorption wavelength of procyanidin

如圖1所示，選擇出最大吸收波長為500 nm。

2.2 標準曲線繪制

根據原花青素標品所測結果得出標準曲線如圖2所示。

圖2 原花青素標準曲線Fig.2 Standard curve of procyanidins

原花青素其標準曲線函數為：y=1.176x+0.007，相關系數R2=0.997 8。式中：x為樣品中原花青素質量濃度，mg/mL；y為吸光度。

2.3 單因素試驗

2.3.1 水浴溫度對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶50（g/mL）、超聲時間 30 min、超聲溫度 30 ℃，乙醇體積分數60%，水浴時間50 min，考察水浴溫度對原花青素提取效果的影響，見圖3。

圖3 水浴溫度對原花青素提取率的影響Fig.3 Influence of water bath temperature on extraction rate of procyanidins

如圖3所示，在30℃～50℃時提取率隨溫度升高而上升，50℃之后隨溫度上升提取率幾乎呈直線降低，原因可能是當溫度超過一定數值時，原花青素結構受到破壞，使提取率下降，且水浴溫度越高所需能耗越大。因此，最適水浴溫度選擇為50℃。

2.3.2 水浴時間對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶50（g/mL）、超聲時間 30 min、超聲溫度 30℃，乙醇體積分數60%，水浴溫度60℃，考察水浴時間對原花青素提取效果的影響，見圖4。

圖4 水浴時間對原花青素提取率的影響Fig.4 Influence of water bath time on extraction rate of procyanidins

如圖4所示，水浴時間在30 min～50 min期間，提取率隨時間增加而增加，時間達到50 min后，提取率隨時間變化不顯著，且略有下降趨勢。其原因可能是在水浴時間達到50 min后，原料中原花青素提取達到上限，因此提取率不隨時間增長而增長，同時浸提液中原花青素在60℃下發生少量分解使提取率略有降低。綜上所得，水浴時間為50 min最佳。

2.3.3 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶50（g/mL）、超聲時間 30 min、超聲溫度 30 ℃、水浴溫度60℃、水浴時間50 min，考察乙醇體積分數對原花青素提取效果的影響，見圖5。

圖5 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響Fig.5 Effcect of ethanol concentration on the extraction rate of proanthocyanidins

如圖5所示，隨著乙醇體積分數增高，原花青素提取率呈上升趨勢，在體積分數達到70%后，提取率開始降低?？赡苁怯捎陔S乙醇體積分數增加，極性增大，原料中醇溶性和脂溶性成分溶出率增加，使原花青素與乙醇-水分子結合率降低，從而使原花青素提取率降低。另外，高濃度乙醇使原料中蛋白質等生物大分子變性沉淀，使原花青素溶出阻力增大，降低提取效果。體積分數在60%和70%時，提取率無顯著差異，綜合考慮，確定乙醇體積分數為60%。

2.3.4 料液比對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定乙醇體積分數60%、超聲時間30 min、超聲溫度30℃、水浴溫度60 ℃、水浴時間50min，考察料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）對原花青素提取效果的影響，見圖6。

圖6 料液比對原花青素提取率的影響Fig.6 Effcect of solid-liquid ratio on the extraction rate of proanthocyanidins

如圖6所示，原花青素提取效果隨料液比的增加呈先增大后降低趨勢，料液比為1∶40（g/mL）時提取率最高。隨著溶劑含量上升，溶質不斷從原料中析出，當料液比達到1∶40（g/mL）時，溶質析出呈最高水平，繼續增加溶劑則使原料中各種雜質析出，使原花青素提取率下降，另外，原花青素含量一定時，溶劑體積增加使原花青素在溶液中濃度下降，使得提取率降低。因此，選擇料液比為1∶40（g/mL）最佳。

2.3.5 超聲溫度對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分數60%、超聲時間30 min、水浴溫度60℃、水浴時間50 min，考察超聲溫度30、40、50、60、70℃對原花青素提取效果的影響，見圖7。

如圖7所示，原花青素提取率隨溫度變化趨勢為先升高后降低，在40℃時達到最高。其原因可能是，溫度升高，分子動能增大，原花青素快速大量溶出；溫度過高，部分原花青素被破壞，使提取率降低。由此確定最佳超聲溫度為40℃。

圖7 超聲溫度對原花青素提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of proanthocyanidins

2.3.6 超聲時間對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分數60%、超聲溫度40℃、水浴溫度 60 ℃、水浴時間 50 min，考察超聲時間 10、20、30、40、50 min對原花青素提取效果的影響，見圖8。

圖8 超聲時間對原花青素提取率的影響Fig.8 Effcect of ultrasonic time on the extraction rate of proanthocyanidins

如圖8所示，原花青素提取率在超聲時間為20min時達到最高，此時原花青素已基本提取完全。超聲處理時間過長，可能導致原花青素結構被破壞，同時，原花青素長時間暴露空氣中易受氧化，使提取率下降。且長時間超聲處理，增加能耗，延長提取周期，增加提取成本，因此20 min為最佳超聲時間。

2.2 正交試驗優化提取工藝

在單因素試驗的基礎上，對料液比、乙醇體積分數、超聲溫度和超聲時間4個因素進行四因素三水平正交試驗。探究各因素對原花青素提取效果的影響情況，并對提取條件進行優化。正交試驗結果如表2、表3所示。

如表3所示，F檢驗結果表明，4個因素對原花青素提取率的影響都不顯著。究其原因可能是本例試驗誤差過大且誤差自由度?。▋H為2），使檢驗的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。由于各因素對提取率的影響都不顯著，因此不必再進行各因素水平間的多重比較。可直接進行直觀分析。直觀分析法又稱極差分析方法，通過比較各因素水平極差的大小，確定各因素主、次地位及最佳水平，極差越大，對原花青素提取率的影響越大[24]。如表2所示，極差分析結果表明，在ABCD這4個因素中，影響主次為C＞D＞A＞B，說明超聲時間（C因素）對原花青素提取率的影響最大，占影響因素43.38%，其次為乙醇體積分數（D因素），占影響因素28.68%，料液比（A因素）和超聲溫度（B因素）影響較少，分別占17.65%和10.29%。最優條件為 A3B1C1D2，即料液比為 1∶45（g/mL）、超聲溫度 35℃、超聲時間15 min、乙醇體積分數60%。按照最優工藝條件進行驗證試驗，經過3次平行試驗得到原花青素提取率平均值為9.07%。與正交試驗最優組結果相比有所增加，因此所得最佳提取工藝具有參考價值。

表2 正交試驗結果直觀分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

表3 各因素結果方差分析Table 3 Variance analysis of the results of various factors

3 結論

本研究在經過超聲波輔助提取后，再利用水浴浸提進一步提高提取效果，并用正交試驗對原花青素的提取工藝進行優化。綜合單因素試驗和正交試驗結果，最終確定各因素對原花青素提取效果的影響主次依次為：超聲時間＞乙醇體積分數＞料液比＞超聲溫度；最佳提取條件為：超聲時間15 min、乙醇體積分數60%、料液比 1∶45（g/mL）、超聲溫度 35℃、水浴溫度50℃、水浴時間50 min。在此條件下，原花青素最大提取率為9.07%，試驗結果較單獨使用超聲提取或水浴浸提皆有所提高。本研究為花生紅衣這一副產物高質化利用提供一定參考依據，具有較好的應用前景。