生料液態釀酒工藝研究與品質檢測

王端好，王震，胡吉祥，韓孟姚，仲杰

（黃淮學院生物與食品工程學院，河南 駐馬店 463000）

生料液態釀酒就是小曲中微生物在液態中將谷物淀粉先糖化，后發酵生成酒精和香味香氣物質的過程[1]。在釀酒過程中，產胞外水解酶的微生物利用自身代謝所產生的酶將生淀粉轉化成葡萄糖，將蛋白質水解為氨基酸等。在無氧的情況下，葡萄糖進入酵母菌細胞后代謝生成乙醇，并排出細胞外，在相關酶的作用下，產生一些香味香氣成分[2-4]。與傳統熟料工藝相比，可以節約能源，提高出酒率。由于是在液態下發酵，具有操作簡便，便于工業化生產等優點[5-8]。

清香型白酒香味醇厚而持久，無其它雜味，顏色清亮、透明，口感柔和、協調，入口軟而甜、清爽、干凈，深受廣大消費者的喜愛[9]。大米中除含有70%～80%的淀粉之外，還含有蛋白質、脂肪、維生素、礦物質、膳食纖維和小分子氨基酸等成分[10-11]，適合作為釀酒原料。我國作為世界上第一大米生產國，利用大米釀酒可以釀造出具有米香味的清香型白酒，同時提高大米的附加值。

本文擬研究以大米為釀酒原料，以小曲為糖化發酵劑，用生料液態發酵法發酵生產清香型大米酒生產工藝，并對酒質進行檢測，此研究在現有文獻中未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小曲：黃淮學院發酵工程實驗室自制；大米：市售，粉碎至通過網孔2 mm的網篩；鹽酸（分析純）：佛山市華希盛化工有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱（BCD-252KU）：河南新飛電器有限公司；旋轉蒸發儀（RH52-3）：上海滬西分析儀器廠有限公司；酒度計（BL501）：深圳市博萊森電子科技有限公司；氣相色譜儀（GC-2014）：日本島津公司；酒精發酵罐（GD-FJ-100L）：溫州古德輕工機械有限公司；蒸餾器（D35L）：家多寶釀酒機械；網篩：浙江上虞五四儀器篩具廠。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶發酵

按照大米、水和小曲 100∶300∶0.8（質量比）的比例，在30℃下錐形瓶中密閉發酵12 d，從第2天開始到第5天，每天定時打開錐形瓶的密封口用玻璃棒兩次攪拌然后再密封；從第3天開始，每天定時檢測一次發酵液的酒精度；從第6天開始密閉發酵。

1.3.2 單因素試驗

采用單因素試驗對發酵溫度、小曲添加量和培養基初始pH值3個因素進行優化。優化發酵溫度時，固定小曲添加量為0.8%（以大米為100 g計），培養基初始pH值為7，以發酵溫度為變量，以酒精含量為指標，選擇最佳發酵溫度；優化小曲添加量時，固定發酵溫度為30℃，培養基初始pH值為7，以小曲添加量為變量，以酒精含量為指標，選擇最佳小曲添加量；優化培養基初始pH值時，固定發酵溫度為30℃，小曲添加量為0.8%，以培養基初始pH值為變量，以酒精含量為指標，選擇最佳初始pH值。

1.3.3 響應面分析試驗

在單因素優化試驗的基礎上，對發酵溫度、小曲添加量和培養基初始pH值運用Box-Behnken設計三因素三水平響應面試驗，以酒精含量為響應值進行響應面優化，試驗設計見表1[12]。運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行方差分析[13]。

表1 Box-Behnken試驗設計因素和水平Table 1 Experimental factors and levels in Box-Behnken

1.3.4 小試放大試驗

按照響應面優化后的發酵工藝，在100 L的帶有攪拌器的厭氧發酵罐中進行小試放大生產大米酒。從第2天開始到第5天每天定時打開發酵罐，進行攪拌和換氣兩次，然后密封，從第6天開始密閉發酵。

1.3.5 酒精檢測

取發酵液100 mL，添加50 mL去離子水混勻，進行蒸餾，蒸餾溫度75℃，當餾出液為20 mL時停止蒸餾，用酒度計檢測酒精含量。

1.3.6 酒質檢測

測定甲醇含量的方法參考GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》；測定乙酸乙酯含量的方法參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵溫度的影響

發酵溫度對釀酒結果影響顯著，溫度對生物體內的一系列生物化學反應影響重大，對酶的種類和活性影響也較大，從而影響酶促反應速率和方向，進而影響代謝產物的種類和產量，最適溫度促進微生物的良好生長及其代謝產物的合成[14]。不同發酵溫度對酒精含量的影響見圖1。

圖1 發酵溫度對酒精含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content

如圖1所示，在3 d～11 d期間，各組酒精含量隨著時間的延長持續增大，到第12天時，酒精含量未明顯增加。發酵溫度為15、20℃時，發酵液中的酒精含量均較低。當發酵溫度分別為25、30、35℃時，酒精含量均較高，發酵液中的微生物的代謝速度快，產酒的速度也快。發酵溫度為30℃時發酵液中的酒精含量最高，所以取最佳發酵溫度為30℃。

2.1.2 小曲添加量的影響

小曲是釀酒的糖化發酵劑[15]，曲中含有很多種菌種，其中最主要的是霉菌，以根霉為主的小曲，酒化力最強，因此用它作為糖化發酵劑用量很少，而且發酵期短、出酒率高[16]。不同小曲添加量對酒精含量的影響見圖2。

圖2 小曲添加量對酒精含量的影響Fig.2 Effect of addition of xiaoqu on alcohol content

如圖2所示，隨著時間的延長，發酵液中的酒精含量均逐漸增大；當小曲添加量為0.4%和0.6%時，發酵液中的酒精含量較低。當小曲添加量為0.8%、1.0%和1.2%時，發酵液中的酒精含量較高。小曲添加量為1.0%時，酒精含量最高。小曲添加量高，酒曲的用量大，糖化發酵劑的量增大，糖化發酵速度快，但在一定條件下，小曲添加量過大時，由于微生物在糖化發酵初期生長速率過大，導致局部缺氧，反而使糖化不徹底，酒精生成量降低，導致出酒率降低。故此取最佳小曲添加量為1.0%。

2.1.3 培養基初始pH值的影響

培養基的pH值影響微生物的細胞結構和酶的活性，從而影響微生物的生長和代謝，進而影響代謝產物的種類和數量[17]。培養基不同初始pH值對酒精含量的影響見圖3。

如圖3所示，隨著時間的延長，發酵液中的酒精含量均逐漸增大；培養基初始pH值為6時，酒精度最高，培養基初始pH值為5和7時，酒精含量較低。每一類微生物都有其特定的耐受和最適pH值范圍，在最佳pH值的范圍內能夠促進微生物的生長和產物合成，以獲得較高的產量。當培養基初始pH值為6時，促進了小曲內菌的生長，進而促進了產物的合成，獲得最高產量。所以取培養基最佳初始pH值為6。

圖3 培養基初始pH值對酒精含量的影響Fig.3 Effect of initial pH of medium on alcohol content

2.2 響應面分析結果

按照Box-Behnken試驗原理，設計了27個試驗點的響應面分析試驗，結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Experimental design and responses in Box-Behnken

由表2得出二次回歸方程式為Y=-130.631 25+1.345 83A-4.145 83B+50.275 00C-0.125 00AB+9.325 87×10-6AC+0.625 00BC-0.019 917A2+4.739 58B2-4.241 67C2。

計算各項回歸系數，以這些回歸系數建立酒精含量（Y）與A發酵溫度、B小曲添加量和C培養基初始pH值3個因素的數學回歸模型。方差分析結果見表3。

表3 響應面回歸方程解析Table 3 Response surface regression equation analysis

由表3可知，模型的一次項A影響高度顯著，B影響極顯著，C影響不顯著。從F值可以看出，單因素對酒精含量的影響順序依次是A>B>C，即發酵溫度>小曲添加量>初始pH值。二次項C2影響高度顯著，A2影響極顯著，B2影響不顯著。交互項影響不顯著。從整體分析，模型P<0.000 1，表明該二次多項回歸模型高度顯著，失擬項P不顯著，表明模型與實際情況擬合較好。因此可以采用此模型對大米酒的發酵工藝條件進行分析和預測。

對A發酵溫度、B小曲添加量、C培養基初始pH值3因素兩兩作交互作用分析，其響應面見圖4。等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[18]。

由圖4可知，發酵溫度和小曲添加量、培養基初始pH值和小曲添加量之間交互作用顯著。

圖4 響應面法各因素交互作用分析Fig.4 Analysis of interaction of various factors by response surface methodology

通過對以上獲得的二次方程回歸模型進行數學分析可知，以大米為原料，生料液態釀酒最優工藝參數為發酵溫度30.02℃、小曲添加量1.2%、培養基初始pH值6.01，在此優化條件下，酒精含量理論值為42.6197°。為了進一步驗證響應面分析結果的可靠性，為方便實際操作，選擇發酵溫度30℃、小曲添加量為1.2%、培養基初始pH值6作為最優條件。重復3次，測得酒精含量分別為 42.608 8、42.610 5、42.609 9 °，取平均值為42.609 7°。與理論值相比，相對誤差較小。因此，采用響應面法優化得到的生料液態釀酒工藝參數準確可靠，可進行下一步放大試驗。

2.3 小試放大試驗結果

在100 L發酵罐內進行小試放大試驗。發酵到第3天就開始產生氣體，到了第5天發酵液就發出較為強大的酒香味，發酵10 d后，發酵液上面一層顏色變深，第12天發酵液上面一層變為咖啡色，下罐。用蒸酒器蒸餾，去酒頭和酒尾，然后進行調制，出酒率達到每100 kg大米生產出50°白酒109.5 kg。酒體清亮、透明，入口柔和、協調，并具有大米的清香味。

2.4 酒質檢測結果

對發酵試驗生產出的原漿50°成品酒進行品評，具有“清香醇厚、綿柔回甜、尾凈爽口、回味悠長”的特點，同時還具有大米特有的清香味。

酒體中最重要的香味物質是乙酸乙酯，乙酸乙酯的含量決定了酒體的質量，而甲醇卻是有害物質，含量過高會對人體造成傷害，所以甲醇在酒體中的含量要低于國家標準。因此，需要對成品酒中的乙酸乙酯和甲醇的含量進行鑒定分析。用氣相色譜檢測的圖譜見圖5，氣相色譜檢測結果分析見表4，成品酒鑒定結果見表5。

圖5 氣相色譜檢測圖譜Fig.5 Gas chromatographic detection atlas

表4 氣相色譜檢測結果分析Table 4 Analysis table of gas chromatography detection results

表5 成品酒鑒定結果Table 5 The detection results of the wine

由此可知，成品酒中乙酸乙酯含量為0.43 g/L，根據GB/T 10781.2—2006《清香型白酒》的標準，該成品酒符合國家一級白酒的標準；甲醇含量僅為0.08 g/L，遠遠低于國家標準，質量安全。因此該大米酒符合國家標準，可有計劃的大力推廣生產。

3 結論

通過單因素和響應面分析，建立了發酵生產大米酒中含量酒精的二次多項式數學模型。經檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預測酒精產量。確定小曲生料液態發酵生產大米清香型白酒的最終優化工藝參數：發酵溫度30℃、小曲添加量1.2%、培養基初始pH值為6。在發酵罐進行小試發酵12 d時50°白酒出酒率達到109.5%，出酒率高于現有文獻報道的數量。

該大米酒酒體清亮、透明，入口柔和、協調，并具有大米的清香味。通過氣相色譜檢測，乙酸乙酯含量為0.43 g/L，符合國家一級清香型白酒的標準；甲醇含量僅為0.08 g/L，遠低于國家標準，質量安全。該產品成本低，勞動強度小，出酒率高，產品質量優，為下一步工業化生產奠定了基礎。