甜瓣子發酵過程細菌菌群與發酵過程的對應關系分析

張小鳳，胡濤，于松峰，夏夢雷，鄭宇，*，石磊，萬守朋*，王敏

（1.食品營養與安全國家重點實驗室，天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津市利民調料有限公司，天津 300308）

豆瓣辣椒醬味美色艷又營養豐富，是川菜烹調中必不可少的調味品，以蠶豆、辣椒、鹽、小麥粉為主要原料[1]。其中，甜瓣子是豆瓣辣椒醬的重要組成，是以蠶豆為原料，浸泡蒸煮后拌以小麥粉并接種米曲霉（Aspergillus oryzae）后進行制曲，隨后拌以食鹽進行3～6個月的甜瓣子發酵[2-4]。甜瓣子的品質是決定豆瓣辣椒醬品質的關鍵，甜瓣子在自然發酵過程中受到發酵條件、微生物組成等多種因素的影響[5]。甜瓣子發酵過程中參與的微生物種類眾多，主要有霉菌、酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等微生物，在蛋白酶、淀粉酶等酶系作用下將原料中大分子物質分解，并代謝產生多肽、氨基酸、有機酸和各種揮發性風味物質[5-7]。有報道采用傳統分離方法和現代分子生物學相結合的手段從中分離出8個屬的微生物菌群，其中細菌主要為Bacillus屬、Lactobacillus屬、Weissella屬、Staphylococcus屬，優勢細菌芽孢桿菌在發酵體系中具有豐富的類群，主要包括枯草芽孢桿菌（B.subtili）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefacuens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和甲基營養型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）等；真菌主要為 Aspergillus屬、Lichtheimia 屬、Zygosaccharomyces屬、Yarrowia屬，發酵過程中細菌濃度高于真菌[8]。微生物組成、鹽度和發酵模式等因素對產品品質有很大影響，利用高效乳酸菌和米曲霉強化甜瓣子發酵，提高了甜瓣子風味物質含量，使終產品質量有明顯提升[9-10]。鹽度對甜瓣子中總酸、氨基酸態氮和還原糖等成分有著顯著影響，12%鹽度下發酵甜瓣子感官品質最佳，另外，采用先低鹽后高鹽、先低溫后高溫的分段發酵模式進行甜瓣子發酵，可使產品品質有明顯提高[11]。

以往研究更多關注甜瓣子發酵微生物組成，采用傳統培養、非傳統培養及高通量測序的方法研究了不同醬類的細菌群落演替規律及風味物質組成[12-18]，但對甜瓣子發酵過程中微生物群落演替及其與發酵條件之間的關系認識不夠深入。本研究利用高通量測序技術解析豆瓣辣椒醬甜瓣子發酵過程中細菌群落與發酵過程的對應關系，挖掘甜瓣子發酵過程中核心功能性微生物，可以為傳統甜瓣子發酵過程和品質管理提供理論依據，從而進一步保障豆瓣辣椒醬品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集生產車間蠶豆曲發酵 0、7、60、120、240 d 的樣品，樣品依次標記為T1～T5。自發酵池表面30 cm處五點法取樣，混勻后裝入無菌瓶中，放入冰盒中立即送往實驗室保存于4℃。每個發酵時間樣品取自3個發酵池，作為平行樣品。

DuGreen 核酸染料、6×DNA Loading dye：寶日醫生物工程（大連）有限公司；深加工食品DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

微量紫外分光光度計（UVmini-1240）：日本島津儀器有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（5331）：德國 Eppendorf公司；凝膠成像儀（Gel Doc XR+）：美國BioRad公司；氣-質聯用分析儀 （gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS）[6890N-5973，配有電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI Source） 及 NIST（national institute of standards and technology）譜庫]：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 蠶豆曲發酵過程主要參數分析

稱取約5.0 g已研磨均勻的樣品置于100 mL小燒杯中，加去離子水攪拌均勻后定容至100 mL，備用。參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》中相應的規定對不同發酵階段樣品中的總酸、氨基酸態氮、pH值、鹽度、還原糖和水分進行測定，采用DNS法測定樣品中的還原糖含量[19]。

1.3.2 蠶豆曲發酵過程中細菌群落組成分析

樣品預處理：取蠶豆曲發酵樣品10.0 g，放入50 mL的無菌離心管中，加入一定量的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）無菌水，漩渦振蕩后，8 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用PBS洗滌沉淀，8 000 r/min離心15 min，棄上清液，收集菌體[20]。采用深加工食品DNA提取試劑盒按照說明書流程提取蠶豆曲發酵樣品基因組。

將細菌基因組，送金唯智基因公司測序，選擇相對豐度大于1%的主要微生物進行分析，利用SILVA 123數據庫對測序結果進行比對分析，選擇同源性最高的菌種屬來解析微生物群落組成。根據測序與比對分析結果，計算微生物的多樣性指數，物種優勢度-Berger-Parker（d）、物種豐富度-Margalef（dMa）、物種多樣性-Simpson（D）、群落多樣性-Shannon（H′）、群落的均勻程度-Pielou（Je）。

1.4 發酵條件與主要功能微生物之間的對應關系分析

本研究分別采用典范對應分析（canonical correspondence analysis，CCA）和 Person相關性檢驗，以發酵參數（pH值、總酸、氨基酸態氮、還原糖、鹽度、水分）為環境變量，研究微生物與環境因素之間的對應關系。

2 結果與分析

2.1 甜瓣子發酵過程主要理化參數變化規律

甜瓣子發酵過程中pH值、總酸、氨基酸態氮、還原糖、鹽度和水分的發酵過程曲線如圖1所示。

圖1 甜瓣子發酵過程曲線Fig.1 The time curves of Tianbanzi fermentation

甜瓣子的品質影響著最終豆瓣辣椒醬的品質的優劣。氨基酸態氮是是衡量營養價值的一項重要指標，也影響甜瓣子發酵品質的一個重要參數[21]。如圖1所示，由于蠶豆中蛋白質等物質的水解，在甜瓣子發酵過程中其含量快速增加，隨后呈下降趨勢。在發酵前期蛋白質會降解成多肽、氨基酸等物質，在發酵中期和后期這些多肽和氨基酸與糖類等其它物質發生復雜的生化反應，從而形成各種風味物質。在此期間淀粉類物質也會分解成小分子糖類等。還原糖等糖類物質不僅是發酵過程微生物生長所需的碳源，也對蠶豆曲發酵及產品的色香味有重要影響。還原糖在發酵60 d時含量達到最高為（1.312±0.022）g/100 g，其后略有下降。總酸是甜瓣子發酵過程中一個重要指標，適度的酸度，能增加產品風味，產生爽口的感覺[22]，隨著發酵的進行，總酸的含量逐漸增加。發酵過程中乳酸菌等微生物可以發酵蠶豆曲中碳水化合物、脂肪等，產生乳酸、乙酸等小分子有機酸，使得總酸增加和pH值下降[23]。食鹽是生產豆瓣醬的重要原料之一，能與氨基酸共同呈鮮味，并且較高濃度的食鹽可以在一定程度上減少雜菌的污染，維持某些耐鹽菌的生長環境，并增加產品的風味[5，11，18]。從圖 1 可以看出，成曲食鹽含量為（0.740 0±0.320 5）g/100 g，加入鹽水后保持在 11 g/100 g～13 g/100 g。圖1中還原糖、水分等部分指標在發酵中后期誤差較大，其原因主要是由于甜瓣子采用自然發酵工藝，不同發酵池的3個平行樣品之間的誤差偏大，這也是許多傳統發酵食品生產中存在的普遍現象。

2.2 發酵過程細菌群落分析

甜瓣子發酵過程細菌菌群組成分析結果如圖2所示。

圖2 甜瓣子發酵過程中細菌群落組成分析Fig.2 Composition of bacterial community during Tianbanzi fermentation

發酵初期（0 d）細菌相對濃度較高。乳酸菌是主要的微生物，主要有 La.plantarum、W.viridescens、W.diestrammenae、Le.citreum、La.siliginis等，其相對豐度分別達到10.35%、8.91%、4.99%、7.35%和10.65%。La.acidifarinae和T.halophilus同樣在發酵初期就存在，但隨著發酵的進行，其相對豐度呈先升高后降低的趨勢，且在發酵中期（60 d）時達到最高分別為12.79%和10.03%。E.faecium是到發酵中期（60 d）時才出現，其豐度隨后呈降低趨勢。除此之外，甜瓣子發酵過程的優勢菌還有 B.ginsengihumi、B.amyloliquefaciens、B.atrophaeus、A.lipolyticus等，這些細菌一直伴隨于甜瓣子整個發酵過程中，并且具有較高的豐度。在發酵初期，細菌的濃度和種類較多，隨著鹽水的加入（圖1），多數細菌不適應此類高鹽條件而死亡，同時發酵過程酸度逐漸增加，因此發酵后期細菌的濃度低于發酵初期，此結果與他人報道的結果一致[11，13，24]。細菌群落組成多樣性分析見圖3。

圖3 細菌群落組成多樣性分析Fig.3 Diversity analysis of bacterial community

進一步，對甜瓣子發酵過程細菌群落多樣性進行了分析，由圖3可知，物種優勢度指數（d）和物種豐富度指數（dMa）在發酵過程中呈先降低后升高的趨勢。物種多樣性指數（H′）和物種豐富度指數（dMa）變化趨勢相同，甜瓣子發酵過程中主要為乳酸菌和芽孢桿菌屬，其種類和數量先減少后增加，物種多樣性指數（H′）和豐富度指數（dMa）先降低后升高。成曲（發酵0 d）的物種多樣性指數（D）最高，這與成曲所在的環境有關，而物種均勻度指數（Je）在發酵過程差異不大。

2.3 甜瓣子發酵過程主要細菌演替機制分析

傳統發酵食品生產多以經驗為主，然而發酵過程與復雜的微生物群落結構有很強的相關性。基于最近微生物生態學研究進展的啟發，采用典范對應分析（CCA）結合Person相關性檢驗的方法探討甜瓣子發酵過程中細菌群落與發酵環境之間的關系。典范對應分析甜瓣子發酵過程與細菌群落組成的關系見圖4。

如圖4所示，兩軸共解釋了92.6%的變量，每個參數箭頭的長短代表各因素影響的大小。在起始發酵（0 d）時期，pH值與Weissella和Lactobacillus表現出顯著的正相關性，但在發酵后期（120、240 d）與Weissella和Lactobacillus負相關。而氨基酸態氮、總酸和還原糖等參數在起始發酵時期與Bacillus、Leuconostoc、Tetragenococcus和Staphylococcus呈負相關，但在發酵后期卻與這些微生物呈正相關。鹽度和水分與Bacillus、Leuconostoc和Tetragenococcus之間具有較高的相關性，由于Bacillus和Tetragenococcus較強的耐鹽能力，存在于整個發酵過程，該結果與其他高鹽醬類產品的結果一致[11，25-26]。La.plantarum、La.acidifarinae、Le.citreum、T.halophilus等乳酸菌是發酵過程中優勢菌，CCA分析結果表明，還原糖和氨基酸態氮與這些微生物相關性較高。在傳統食品發酵過程中，乳酸菌能夠產生有機酸、丁二酮和細菌素等，具有抑制致病菌和腐敗菌的作用，對產品風味，以及維持產品的色澤等具有重要作用[27-29]。結合甜瓣子發酵過程動態曲線可知，隨著發酵的進行，總酸含量升高及pH值下降，T.halophila相對豐度在發酵中期較高，推測其豐度的變化與總酸和pH值變化有關。K.oxytoca、La.plantarum、W.viridescens和B.ginsengihumi等微生物隨著發酵時間的增長而有減少的趨勢，說明這些微生物在高鹽環境下的生長受到抑制。

圖4 甜瓣子發酵過程與細菌群落組成的典范對應關系分析Fig.4 Canonical correspondence analysis between fermentation process and bacteria compositions of Tianbanzi

甜瓣子發酵過程中主要細菌與發酵環境之間的Person相關性系數見表1。

甜瓣子發酵過程中主要細菌與發酵環境之間的Person相關性系數見表1，Person相關性檢驗表明，鹽度、水分、氨基酸態氮、總酸和還原糖等主要與Leuconostoc、Tetragenococcus、Bacillus、Klebsiella 和 Staphylococcus的相對豐度呈正相關，而與Lactobacillus和Weissella呈負相關，該結果也與CCA分析結果一致（圖4）。pH值與微生物之間的相關性表現出與鹽度、氨基酸態氮、總酸和還原糖相反的結果。Tetragenococcus是一種耐鹽細菌，在其他傳統發酵食品也被檢測到。在醬油的發酵過程中，Lactobacillus、Tetragenococcus 和Weissella均屬于優勢菌群，在發酵過程產生有機酸，調節發酵體系的pH值，與總酸增加及pH值的下降相關，并且這些乳酸菌還賦予了產品良好的功能和風味[30]。

表1 甜瓣子發酵過程中主要細菌與發酵環境之間的Person相關性系數Table 1 Pearson′s correlation coefficients between dominant bacterial and fermentation conditions during Tianbanzi fermentation process

3 結論

豆瓣辣椒醬甜瓣子發酵2個月的樣品中還原糖及氨基酸態氮含量達到最高，與微生物旺盛的代謝活動有關。乳酸菌以及芽孢桿菌屬是豆瓣辣椒醬甜瓣子發酵過程主要的細菌。發酵過程中，pH值、鹽度、氨基酸態氮、總酸和還原糖等發酵條件與Lactobacillus、Leuconostoc、Tetragenococcus、Bacillus、Klebsiella 和 Weissella具有較高的相關性，說明這些細菌是發酵過程中的主要功能微生物，它們對發酵過程和產品風味的影響及其作用機制將是今后研究的重點。