高原高寒條件對兔模型嚴重腹腔感染的影響

段光輝，瞿洪洋，高笑欣，尚力凝，杜成周，陳鵬，李洪濤*

1解放軍聯勤保障部隊第940醫院普通外科，蘭州 730050；2寧夏醫科大學研究生院，銀川 750004

我國地勢由東至西呈三階梯分布，通常依據海拔高度、地理地貌、溫度等自然因素分為平原、亞高原和高原。高原高寒地區通常指由大氣壓、溫度等因素引起機體生物學、生理學效應的特殊地區，一般海拔平均處于3000 m以上，溫度-25 ℃以下。我國海拔3000 m以上國土面積占全國面積的近1/4，約3400萬人在高原地區從事生產生活。隨著國家西部大開發政策的逐步落地，西部地區經濟蓬勃發展，在高原地區工作、生活、旅游的人數逐年增加，因此，交通事故、醫療因素及創傷導致的腹部創傷病例逐年增多。腹部創傷及術后繼發的感染極易并發嚴重的腹腔感染，進一步誘發急性全身炎癥反應綜合征，具有高病死率、預后差等特點[1]。腹腔感染依照感染源的差異可分為社區獲得性和衛生保健相關性腹腔感染，按照感染侵襲范圍和感染程度可分為復雜腹腔感染和非復雜腹腔感染[2-3]。國外研究腹腔感染的進程、轉歸發現，復雜腹腔感染患者的病死率為9.2%，且其中10%～55%的患者可進展為膿毒癥休克，病死率高達67.8%[4-7]。2020年任建安教授團隊依據我國腹腔感染疾病的特點，制定了中國腹腔感染診治指南，指出腹腔感染以多類型細菌混合感染為主，且在特殊情況下伴有厭氧菌、真菌感染[8-10]，當臨床上確診為腹腔感染所致膿毒癥或機體進入感染性休克后，應盡早實施抗感染治療，積極清除感染灶，降低感染加重危及生命的可能性。但目前該類疾病的治療方案及經驗大多基于平原地區病例，尚未有明確的高原地區相關疾病診療指南及經驗總結。因此，本研究建立盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)動物模型[11]，從感染指標、營養代謝、重要臟器功能、感染致病菌群等方面分析高原高寒條件對腹腔感染的影響，以期為臨床工作提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 血常規試劑、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)試劑盒、白蛋白(albumin，ALB)試劑盒、前白蛋白(prealbumin，PAB)試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；降鈣素原(procalcitonin，PCT)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；HE染色試劑盒(武漢塞維爾生物科技公司)。DYC-3070模擬高原環境動物實驗艙(貴州風雷航空軍械有限公司)；高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；-80 ℃低溫冰箱(德國Dometic公司)；全自動酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)。

1.2 實驗動物及分組 健康新西蘭大耳白兔60只，雌雄不限，5月齡，體重2.5～3.0 kg，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供[實驗動物生產許可證號：SCXK(甘)2015-0001]，由解放軍聯勤保障部隊第940醫院(原蘭州軍區蘭州總醫院)動物實驗中心飼養并提供手術管理。隨機分為平原組(海拔高度100 m，溫度5 ℃)、亞高原組(海拔高度1000 m，溫度-5 ℃)與高原組(海拔高度5000 m，溫度-25 ℃)，每組20只，于相應條件動物飼養艙內飼養14 d，使其機體及內環境適應外界環境。本研究獲得解放軍聯勤保障部隊第940醫院倫理委員會審批(2021KYLL005)，實驗過程符合國家和單位有關實驗動物的管理和使用規定。

1.3 兔盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)模型建立 參照CLP模型建立指南[12]和Quan等[13]的兔多臟器衰竭動物模型改良建立。將各組兔置于相應條件海拔、溫度的高原環境模擬動物飼養艙中飼養14 d，術前12 h禁食。操作時，術者進入動物實驗艙操作艙，將實驗艙內海拔高度、溫度調整至各組要求條件，觀察艙內壓強溫度顯示器，待兩艙氣壓相同時將兔移至實驗艙，稱重，測量基礎肛溫，抽取耳緣靜脈血5 ml，并將耳緣靜脈留置針用肝素封管。麻醉后固定于試驗臺，備皮，取腹部正中切口，長約6 cm，探查腹腔各臟器，尋找回盲部，距盲腸末端約8.0 cm處用絲線結扎盲腸及其相應血管，使盲腸遠端有腸內容物且保證腸腔內有一定壓力，以尖刀片避開周圍血管于盲腸遠端戳孔2次，孔徑直徑約0.5 cm，擠壓腸管，使內容物流出約20 ml后將盲腸原位放回腹腔，腹腔內灌洗30 ml/kg溫生理鹽水(37 ℃)，逐層縫合腹壁切口，包扎后放回飼養艙，并繼續維持各組要求的海拔高度和溫度。術后24、72 h抽取耳緣靜脈血5 ml，并于術后72 h后使用耳緣靜脈空氣栓塞法處死，逐層打開腹部抽取腹水(分裝于EP管中，置于-80 ℃低溫冰箱中保存備用)，采集肝臟、腎臟、小腸組織，用4%中性甲醛溶液固定，用于觀察組織病理學變化。

1.4 實驗監測數據 術前測量各組兔基礎肛溫并稱重，術后每隔4 h監測肛溫、活動狀態等，記錄存活時間。

1.4.1 ELISA法測定感染、營養代謝指標 采用ELISA法測定術前及術后24、72 h靜脈血中ALB、PAB、CRP、PCT、TNF-α水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。

1.4.2 血常規檢驗 采用血常規試劑對術前及術后24、72 h靜脈血進行白細胞計數(WBC)。

1.5 各項感染指標與高原高寒因素的相關性分析 采用Pearson相關法分析WBC、CRP、PCT、TNF-α與高原高寒因素的相關性。

1.6 HE染色觀察重要臟器病理變化 肝臟、腎臟、小腸等組織使用4%中性甲醛溶液固定后，脫水、包蠟、烤片，行HE染色，于高分辨顯微鏡下觀察病理變化。

1.7 腹水細菌培養 采用一般培養法對各組腹水進行細菌培養，將已接種腹水的培養基置于37 ℃培養箱內培養18～24 h。

1.8 統計學處理 應用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量數據采用Shapiro-Wilk(S-W)進行正態性檢驗，符合正態分布的以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，同組術前、術后24 h、術后72 h各項數據比較采用重復測量的方差分析；多組間比較采用Bartlett檢驗方差齊性，P>0.05時采用F檢驗，P≤0.05時采用LSD檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗；應用Kaplan-Meier法計算生存率，組間比較采用Log-rank檢驗；采用Pearson相關法分析各項感染指標與高原高寒因素的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組基線資料比較 平原組、亞高原組和高原組CLP模型兔術前體重、肛溫以及WBC、CRP、PCT、TNF-α、ALB、PAB水平差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 各組基線資料比較(±s, n=20)Tab.1 Comparison of baseline data in each group (±s, n=20)

表1 各組基線資料比較(±s, n=20)Tab.1 Comparison of baseline data in each group (±s, n=20)

項目 平原組 亞高原組 高原組 P體重(kg) 2.81±0.30 2.80±0.10 2.84±0.18 0.823肛溫(℃) 38.3±1.2 37.9±1.4 38.1±1.5 0.142 WBC(×109/L) 4.1±2.1 4.2±1.6 3.9±1.3 0.351 CRP(mg/L) 7.4±1.9 8.1±2.1 8.2±2.3 0.256 PCT(μg/L) 0.5±0.1 0.3±1.4 0.6±0.3 0.334 TNF-α(pg/ml) 4.3±2.1 3.1±2.4 3.4±2.3 0.421 ALB(g/L) 39.86±20.40 36.23±18.50 37.62±17.70 0.571 PAB(g/L) 0.30±0.08 0.32±0.11 0.29±0.13 0.084

2.2 各組CLP模型兔一般情況 各組CLP模型兔均在術后6 h開始出現少動、蜷縮、精神倦怠、呼吸急促且呼吸音粗、腹瀉、眼角滲出物等癥狀。平原組術后肛溫持續升高后緩慢降低，最高為39.2 ℃，最低為36.5 ℃；亞高原組術后肛溫急劇升高后逐漸降低，最高為40.6 ℃，最低為34.9 ℃；高原組術后肛溫急劇升高后迅速降低，最高為41.2 ℃，最低為34.0 ℃(圖1)。

圖1 各組CLP模型兔術后肛溫變化(n=20)Fig.1 The rectal temperature change of CLP model rabbits in each group after operation (n=20)CLP. 盲腸結扎穿孔

2.3 各組CLP模型兔生存情況 術后72 h，平原組死亡7只，生存率為65.0%(13/20)；亞高原組死亡13只，生存率為35.0%(7/20)；高原組死亡18只，生存率為10.0%(2/20)。隨著海拔高度增加、溫度降低，CLP模型兔的生存率逐漸降低(χ2=16.82，P<0.01)(圖2)。術后72 h，各組存活兔腹腔內均可見腸管出現充血水腫，腸壁伴有散在出血點及淤斑，腹腔炎性粘連嚴重，且可見腹水呈淡黃綠色混濁狀態。

圖2 各組CLP模型兔生存曲線Fig.2 The survival curve of CLP model rabbits in each group CLP. 盲腸結扎穿孔

2.4 各組CLP模型兔感染及營養指標變化情況 與術前比較，3組術后24、72 h的WBC、CRP、PCT、TNF-α水平均升高，術后72 h的ALB、PAB水平均降低(P<0.05)。與術后24 h比較，3組術后72 h的PCT、TNF-α水平持續升高，ALB、PAB水平均降低(P<0.05)，但WBC、CRP水平差異無統計學意義(P>0.05)。

術后24、72 h，高原組與亞高原組CLP模型兔靜脈血中PCT、TNF-α水平均高于平原組，且高原組高于亞高原組，差異有統計學意義(P<0.05)；術后72 h，高原組與亞高原組CLP模型兔靜脈血中ALB、PAB水平低于平原組，且高原組低于亞高原組，差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 各組CLP模型兔術后各項感染及營養指標變化(±s，n=20)Tab.2 Changes of infection and nutritional indexes of CLP model rabbits in each group after operation (±s, n=20)

表2 各組CLP模型兔術后各項感染及營養指標變化(±s，n=20)Tab.2 Changes of infection and nutritional indexes of CLP model rabbits in each group after operation (±s, n=20)

CLP. 盲腸結扎穿孔；WBC. 白細胞計數；CRP. C反應蛋白；PCT. 降鈣素原；TNF-α. 腫瘤壞死因子-α；ALB. 白蛋白；PAB. 前白蛋白；與平原組比較，(1)P＜0.05；與亞高原組比較，(2)P＜0.05；與術前比較，(3)P＜0.05；與術后24 h，(4)P＜0.05。

組別 WBC(×109/L) CRP(mg/L) PCT(μg/L) TNF-α(pg/ml) ALB(g/L) PAB(g/L)平原組術前 4.1±2.1 7.4±1.9 0.5±0.1 4.3±2.1 39.9±20.4 0.30±0.08術后24 h 10.9±2.3(3) 22.2±3.8(3) 8.3±1.3(3) 6.5±2.6(3) 39.3±10.7 0.28±0.24術后72 h 12.8±3.3(3) 25.7±7.2(3) 12.6±4.3(3)(4) 11.1±1.8(3)(4) 26.8±7.2(3)(4) 0.18±0.03(3)(4)亞高原組術前 4.2±1.6 8.1±2.1 0.3±1.4 3.1±2.4 36.2±18.5 0.32±0.11術后24 h 10.6±2.2(3) 24.9±3.8(3) 11.3±1.3(1)(3) 11.6±2.6(1)(3) 29.5±8.4 0.16±0.05術后72 h 13.9±3.7(3) 25.9±8.1(3) 17.3±4.3(1)(3)(4) 16.8±1.8(1)(3)(4) 21.9±3.1(1)(3)(4) 0.11±0.01(1)(3)(4)高原組術前 3.9±1.3 8.2±2.3 0.6±0.3 3.4±2.3 37.6±17.7 0.29±0.13術后24 h 12.5±1.3(3) 26.8±2.4(3) 16.9±3.4(1)(2)(3) 15.7±4.8(1)(2)(3) 28.9±4.6 0.16±0.11術后72 h 14.2±2.9(3) 26.1±4.3(3) 25.5±4.9(1)(2)(3)(4) 22.6±5.5(1)(2)(3)(4) 17.6±4.4(1)(2)(3)(4) 0.05±0.01(1)(2)(3)(4)

2.5 各項感染指標與高原高寒因素的相關性分析Pearson相關分析結果顯示，PCT、TNF-α與高原高寒因素呈正相關(r=0.288，P=0.006；r=0.368，P=0.019)，WBC、CRP與高原高寒因素無相關性(r=0.462，P=0.382；r=0.397，P=0.192)。

2.6 各組CLP模型兔重要臟器病理學變化 HE染色結果顯示，各組CLP模型兔術后肝臟、腎臟、小腸組織均有炎性細胞浸潤。平原組肝臟大致正常，肝小葉、肝竇結構清晰、正常，間質僅見少量炎細胞浸潤，腎組織大致正常，伴有炎性細胞浸潤，小腸絨毛結構大致正常，固有層有少量淋巴細胞浸潤。亞高原組肝臟中部分肝竇輕度擴張，肝小葉匯管區結構欠清晰，可見多量淋巴細胞、漿細胞浸潤，腎小管及腎小球周圍間質有較多淋巴細胞、漿細胞浸潤，小腸絨毛稍扭曲、縮短，黏膜固有層見較多淋巴細胞、漿細胞浸潤。高原組肝臟中肝小葉匯管區結構不清，肝竇擴張，可見大量淋巴細胞、漿細胞浸潤，腎小球萎縮硬化，腎小管水腫變性，間質大量淋巴細胞、漿細胞浸潤，小腸絨毛縮短變鈍，腺體扭曲變形，黏膜間質纖維化，可見大量淋巴細胞、漿細胞及中性粒細胞浸潤(圖3)。

圖3 各組肝臟、腎臟、小腸組織病理學變化(HE ×100)Fig.3 Histopathological changes of liver, kidney and small intestine in each group (HE ×100)

2.7 各組CLP模型兔腹腔積液中病原分布情況平原組CLP模型兔腹腔積液中分離出51株病原，其中革蘭陰性菌27株(52.94%)，革蘭陽性菌15株(29.41%)，真菌9株(17.68%)；亞高原組CLP模型兔腹腔積液中分離出69株病原，其中革蘭陰性菌34株(49.27%)，革蘭陽性菌24株(34.78%)，真菌11株(15.94%)；高原組動物腹腔積液中分離出107株病原，其中革蘭陰性菌45株(42.06%)，革蘭陽性菌47株(43.93%)，真菌15株(14.02%)。各組CLP模型兔腹腔積液中病原分布情況如表3所示。

表3 各組CLP模型兔腹腔積液中病原分布情況[株(%)]Tab.3 Distribution of pathogenic bacteria in ascites of CLP model rabbits in each group [n(%)]

3 討 論

腹腔感染已成為腹部創傷及圍術期較為常見的感染，特別是以腹腔臟器術后并發占比較高[14-17]，極易導致炎癥反應失控，進而引起全身炎癥反應綜合征，最終導致死亡[18]。目前，臨床工作中高原高寒地區腹腔感染的診治原則和策略均基于平原地區的流行病學特點。但有研究發現，高原環境創傷具有失血耐受能力低，易休克，易發生腦水腫、肺水腫，死亡率高等特點[19-21]。本研究采用高原模擬實驗艙建立CLP兔模型，對高原高寒條件下影響機體的感染指標、營養代謝、重要臟器功能、感染病原分布等進行分析，以探究高原高寒因素對腹腔感染的影響。

本研究中CLP兔模型參照CLP模型建立指南[12]和Quan等[13]的兔多臟器衰竭動物模型改良而成，實驗中監測基礎肛溫、活動狀態、感染指標、營養指標等，結果顯示，各組CLP模型兔均在術后6 h開始出現少動、蜷縮、精神倦怠、呼吸急促且呼吸音粗、腹瀉、眼角滲出物等癥狀；平原組CLP模型兔的肛溫上升緩慢，感染癥狀發生較晚，后又徘徊在高溫區域并逐漸降低，表明感染緩慢加重；與平原組比較，高原組與亞高原組CLP模型兔的肛溫于術后急速上升，表明感染發生強烈且迅速，隨后肛溫迅速降低，進入休克狀態，表明高原高寒條件下機體更容易進入感染狀態，并極易誘發膿毒癥休克。本研究生存曲線分析顯示，隨著海拔高度增加、溫度降低，CLP模型兔的生存率逐漸降低，表明高原高寒條件是影響CLP模型兔感染程度和死亡的重要因素，且隨著海拔升高、溫度降低，感染程度逐漸加重、病死率逐漸升高。

有研究發現，急進高原及移居或世居高原地區人群體內IgG水平明顯高于平原地區人群[22]，高IgG水平患者發生感染初期可通過自身體液免疫有效控制感染，但隨著體內細菌繁殖數量的增加和毒素的累積，感染與抗感染之間的平衡被打破，病情發展迅速且程度劇烈[23]。后續研究發現，膿毒癥晚期致炎因子與抗炎因子相對失衡，平衡再度被打破，這些因子在體內相互作用，從而引起全身炎癥反應綜合征[23]。但目前關于外界環境因素影響炎性因子變化的研究報道較少，因此本研究建立CLP兔模型，比較各項感染指標在不同海拔高度的變化情況，結果顯示，術后24、72 h高原組與亞高原組CLP模型兔靜脈血中PCT、TNF-α水平高于平原組，且高原組高于亞高原組。該結果與陶瑞雨[24]的研究結果一致。有研究發現，感染時細菌產生的內毒素可使機體內炎性因子增多，雖然早期機體自我防御系統產生的部分炎性因子能起到防御作用[25-29]，但中后期可能導致繼發感染加重，增高病死率，而本研究中，特殊的高原高寒環境加速了這一系列的中和反應，使得炎癥平衡提前被打破，加速了機體的感染進程并導致感染進一步加重。

高原高寒環境對腹腔感染時機體的營養代謝和各重要臟器功能也有重要影響，ALB作為載體參與物質運輸和抗氧化等重要的生理功能，因此血漿ALB濃度常被用于評估營養狀態及判斷預后[30-32]。有研究發現，腹腔感染對機體營養代謝方面的影響可概括為以下幾個方面：(1)感染使機體ALB分解加快，增加營養消耗；(2)在機體感染的影響下，肝臟ALB合成速率降低，合成量明顯減少；(3)感染加重導致機體微環境發生變化，更多的血漿ALB由血管內轉移至血管外[33]。但高原高寒因素是否能夠影響腹腔感染時的營養代謝尚未明確。本研究結果顯示，術后24 h各組ALB、PAB水平無明顯差異；術后72 h，高原組、亞高原組ALB、PAB水平低于平原組。有研究發現，高原低氧可導致機體下丘腦、垂體、甲狀腺、腎上腺皮質和髓質等內分泌器官功能增強，分泌激素量增多[34]，糖、蛋白質、脂肪等物質的有氧代謝過程受到不同程度的抑制，因此，感染初期，高原高寒因素可能增加了各分泌腺體的代償，并抑制了機體的有氧代謝過程，導致前期未見明顯變化。有研究發現，當機體處在高原高寒條件下且感染時間較長時，由于高原環境空氣較為干燥，含氧量低，使機體發生脫水，循環血液黏稠度增高，血液流變性降低，同時由于處于應激狀態，腸黏膜通透性增加，屏障功能下降，易產生缺血性改變，造成機體電解質紊亂，影響營養物質的代謝[35]。本研究CLP模型兔術后腸壁病理切片可見，高原高寒條件能夠導致腸黏膜屏障破壞加快、腸壁細胞損傷加重并增強其通透性，可誘發腸道應激性潰瘍形成，進一步使消化道中的營養物質吸收障礙。隨著感染進一步加重，全身炎癥反應加劇，可激活體內神經內分泌反應和相關激素系統，導致機體分解代謝增加，合成代謝降低[36-38]。本研究CLP模型兔術后肝臟病理切片可見，炎癥浸潤程度也與高原高寒條件密切相關，由于高海拔、低溫、低氧等因素的影響，機體應激反應更加劇烈，可限制營養物質的合成并增加對營養物質的消耗，即肝臟蛋白合成障礙及機體能量消耗增加，該過程中可能產生了負氮平衡。膿毒癥合并多器官衰竭時，因高原高寒條件加重各主要臟器的功能損害，進一步對機體的營養代謝造成嚴重影響。

腹腔感染的致病菌群在高原高寒條件下可發生改變。有研究發現，高原環境可使部分細菌脫水，造成蛋白變性、鹽水濃縮而最終死亡；還可導致空氣中、皮膚表面革蘭陽性球菌占比增高且更容易定植，其中以金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及腸球菌為主[39]。有研究發現，腸道菌群可隨環境、飲食結構的變化而變化[40]。高原地區人群腸道菌群中梭菌占比顯著高于平原地區人群[41]，且其他致病菌也更容易進入機體并發生定植、繁殖和引發炎癥反應，促進腸內細菌與內毒素易位入血，造成后續損害效應，進一步導致嚴重的膿毒癥反應。本研究抽取CLP模型兔的腹腔積液進行培養，分析病原分布情況發現，隨著海拔增高、溫度降低，菌種數量顯著增多，類型比例發生變化，尤其是革蘭陽性菌和真菌數量增加。革蘭陽性菌與真菌混合感染在臨床經驗治療中容易被忽視，且存在加重感染的風險，易誘發膿毒癥，損傷其他臟器的功能，且前期不準確的經驗性用藥容易導致多重耐藥菌的出現[42]。因此，了解特殊環境下菌譜的差異，能夠為腹腔感染前期經驗性抗生素的應用提供借鑒，利于臨床醫師在特殊環境下制定合理的初始抗感染方案，使患者盡早受益。

本研究存在以下不足：(1)受環境條件限制，采用高原模擬實驗艙進行實驗，雖然嚴格把控影響因素，準確記錄各項指標，盡量模擬真實環境，但未能在高原高寒地區進行現場試驗，結果可能存在偏倚；(2)動物模型樣本量較少，觀察時間較短，節點較少，未能詳細測定感染進程及機體變化情況，未來可增加實驗動物數量、觀察指標，并搜集相關臨床病例進行深入研究；(3)動物建模后僅進行了觀察研究，未進行系統的治療干預，數據不夠全面，后續可進行各項治療方式的干預實驗，評估高原高寒條件下腹腔感染的治療效果及疾病預后。

綜上所述，本研究從感染指標、營養代謝、重要臟器功能、感染致病菌群等方面分析高原高寒條件對腹腔感染的影響，結果表明：(1)高原高寒條件下感染發生早且程度重，可迅速損害其他臟器功能；(2)高海拔、低溫因素能夠降低腹腔感染機體的營養吸收與代謝過程，進一步影響疾病的轉歸及預后；(3)高原高寒條件可改變腹腔感染的致病菌群，影響感染的發生與發展，對臨床經驗性抗感染治療提出了新的挑戰。