PSRC1與ANXA2相互作用減緩動脈粥樣硬化進展的作用機制

郭中州，張亞南，劉季晨，郭志剛

南方醫科大學南方醫院心血管內科，廣州 510515

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病[1]，降脂聯合抗炎治療可降低其主要心血管事件的發生率[2-3]。研究證實，巨噬細胞在AS的炎癥反應過程中扮演了重要角色[4]。本課題組前期研究結果顯示，過表達脯氨酸/絲氨酸豐富的卷曲螺旋蛋白1(proline/serine-rich coiled-coil protein 1，PSRC1)可通過抑制巨噬細胞的炎癥反應延緩AS的進展[5]。PSRC1是由PSRC1基因編碼的一種微管結合蛋白，其中一端可與發揮細胞支撐作用的微管蛋白結合以維持細胞骨架的穩定性，但僅存在于胞質內，且其影響巨噬細胞炎性因子釋放的確切分子機制國內外均未見報道。因此，本課題組提出PSRC1的另一端與細胞內某種其他蛋白結合而抑制炎癥反應，進而發揮抑制AS作用的假設，以尋找影響巨噬細胞炎癥反應的新靶點，為防治AS提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠巨噬細胞R AW264.7購自中國典型培養物保藏中心。重組腺病毒載體Ad-PSRC1、Ad-GFP及Ad-shANXA2由和元生物技術(上海)有限公司構建；ox-LDL購自廣州奕源生物科技有限公司，ANXA2單克隆抗體購自研如玉(廣州)生物科技有限公司，DAPI染色液購自上海碧云天生物科技有限公司，RNA提取試劑Trizol及反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，RT-PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司，DMEM培養液、胎牛血清(FBS)、胰酶購自美國Gibco公司，PBS購自美國Thermo Scientific公司；離心管、EP管購自美國Axygen公司；細胞培養瓶、培養皿購自美國Corning公司；牛血清白蛋白(BSA)、油紅O染料購自美國Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Biosharp公司；ANXA2 ELISA試劑盒購自廣州徠智生物科技有限公司，白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6 ELISA試劑盒購自廣州佳研生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 非標記定量蛋白質組學方法鑒定與PSRC1結合上調的蛋白 將RAW264.7巨噬細胞分為Ad-GFP+ox-LDL組(Ad-GFP+100 μg/ml ox-LDL)與Ad-PSRC1+ox-LDL組(Ad-PSRC1+100 μg/ml ox-LDL)。ox-LDL刺激24 h后對細胞進行裂解，使用抗-FLAG?M2磁珠(Millipore，Cat. M8823)對兩組細胞裂解液進行下拉試驗，所獲產物在南方醫科大學中心實驗室使用超高分辨三合一質譜儀(Thermo ScientificTMOrbitrap FusionTMTribridTM)進行數據非依賴(data independent acquisition，DIA)的定量質譜分析，具體步驟如下。首先對樣品進行還原烷基化、胰酶酶解；然后對酶解后肽段除去非揮發性鹽，分別進行數據依賴(data dependent acquisition，DDA)圖譜采集及數據非依賴采集(data independent acquisition，DIA)；最后，將數據導入Skyline軟件(Skyline v4.2 Released on 11/01/2018)進行定量分析。將Ad-PSRC1+ox-LDL組/Ad-GFP+ox-LDL組變化倍數上調1.2倍以上，且錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05的蛋白質作為與PSRC1結合上調的蛋白質。

1.2.2 免疫共沉淀(Co-IP)實驗驗證蛋白質譜結果 過表達Co-IP：構建帶有標簽蛋白的PSRC1真核表達質粒(pcDNA3.1/flag-PSRC1)并轉染至RAW264.7細胞中，以ox-LDL刺激24 h。裂解細胞，提取胞質中的蛋白。采用ANTI-FLAG M2 Magnetic beads(Sigma)進行Co-IP實驗，再用標簽蛋白或相應蛋白抗體進行Western blotting檢測，比較刺激前后ANXA2與PSRC1相互作用的變化。內源Co-IP：使用ANXA2抗體對ox-LDL刺激24 h前后的RAW264.7細胞裂解液進行Co-IP實驗，再采用PSRC1抗體或ANXA2抗體進行Western blotting檢測。

1.2.3 ELISA檢測RAW264.7巨噬細胞過表達PSRC1后在ox-LDL刺激下的ANXA2分泌情況 實驗分為四組：對照組(正常培養RAW264.7細胞培養上清)、ox-LDL組(用100 μg/ml ox-LDL刺激24 h)、Ad-GFP+ox-LDL組(外源過表達GFP后加100 μg/ml ox-LDL刺激24 h)、Ad-PSRC1+ox-LDL組(外源過表達PSRC1后加100 μg/ml ox-LDL刺激24 h)。RAW264.7巨噬細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中，并置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養。12 h后，根據分組情況用同體積的Ad-GFP或Ad-PSRC1轉染、培養細胞48 h。實驗前，各組細胞饑餓24 h處理，用100 μg/ml的ox-LDL干預細胞48 h后使其轉化為泡沫細胞，收集細胞培養上清，采用ELISA法檢測各組上清中ANXA2的水平。

1.2.4 免疫熒光實驗檢測PSRC1、ANXA2的細胞內共定位情況 胰酶消化RAW264.7細胞使其脫落，稀釋至細胞濃度為1×106個/ml，將細胞定植于共聚焦皿中。將4%多聚甲醛20 μl滴至細胞表面，靜置30 min，PBS洗3次；用5% BSA 100 μl對細胞進行封閉1 h，PBS洗2或3次；用5% BSA稀釋一抗，加入ANXA2抗體(兔抗)，濃度為1:100(即1 μl)，同時，加入PSRC1抗體(鼠抗)，濃度為1:100(即1 μl)，避光，4 ℃共同孵育抗體12 h。棄去抗體，PBS輕輕沖洗細胞3次。用PBS稀釋AF488羊抗鼠熒光二抗(1:100)和AF551羊抗兔熒光二抗(1:100)，室溫下以100 μl稀釋好的二抗孵育細胞1 h，避光。棄去二抗，PBS輕輕沖洗細胞3次。加入5% Triton破膜15 min，染DAPI 15 min后，甘油明膠封片，采用共聚焦顯微鏡進行觀察并拍照。

1.2.5 RT-qPCR檢測細胞內ANXA2 mRNA的表達情況 將RAW264.7巨噬細胞分為Ad-GFP組與AdshANXA2組。收集細胞并離心后，棄去舊培養基，加入無菌PBS洗滌，1000 r/min 離心5 min分離細胞，加入Trizol試劑后在4 ℃條件下充分裂解5 min。將獲得的裂解液轉移至1.5 ml EP管中，加入氯仿200 μl充分震蕩，在4 ℃每件下靜置5 min，然后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸出上清轉移至另一個1.5 ml EP管內。取500 μl異丙醇加入EP管，充分震蕩后低溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清，保留RNA沉淀物。將1 ml 75%乙醇加入RNA沉淀中，低溫靜置5 min，然后4 ℃、7500 r/min離心10 min，棄上清，保留最后的RNA沉淀。待RNA沉淀干燥后，EP管內加入20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)進行溶解。將所得RNA反轉錄為cDNA后，按照TaKaRa SYBR Green PCR Master Mix Kit試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR。

1.2.6 油紅O染色檢測主動脈大體及主動脈根部斑塊情況 構建ANXA2敲低的ApoE-/-小鼠模型：將24只8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為四組(n=6)：普通飲食+Ad-GFP組、普通飲食+Ad-shANXA2組、高脂飲食+Ad-GFP組、高脂飲食+Ad-shANXA2組，分別給予普通飼料或高脂飼料喂養。8周后分別經尾靜脈注射Ad-GFP或Ad-shANXA2，注射劑量為5×108pfu。繼續普通飲食或高脂飲食喂養2周，再次分別經尾靜脈注射Ad-GFP或Ad-shANXA2，繼續普通飲食或高脂飲食喂養2周。分離各組小鼠的主動脈大體標本，并取主動脈根部行冷凍切片，對大體及切片行油紅O染色。心尖取血，3000 r/min離心10 min，取上清，分裝后于-80 ℃保存備用。

1.2.7 ELISA法檢測血清中IL-1β及IL-6蛋白表達水平 由于普通飲食兩組小鼠斑塊差異并無統計學意義，而高脂飲食兩組小鼠的斑塊面積差異有統計學意義，因此采用ELISA法進一步對1.2.6中收集的高脂飲食+Ad-GFP組與高脂飲食+Ad-shANXA2組小鼠血清中的IL-1β、IL-6表達水平進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism Version 8.3.0軟件進行統計分析。所有計量資料進行方差齊性檢測，均為正態分布，以表示，兩組間比較采用Student-t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ox-LDL刺激對PSRC1與ANXA2結合的影響通過非標記定量蛋白質組學鑒定與PSRC1結合上調的蛋白(表1)，結果發現RAW264.7巨噬細胞轉染腺病毒過表達PSRC1后，在ox-LDL刺激下，與GFP對照組比較，Ad-PSRC1組免疫共沉淀的質譜總離子流明顯改變，STRING軟件分析發現PSRC1與ANXA2結合明顯升高，增加了8.91倍(圖1)。對上述質譜結果進行Co-IP驗證，發現與蛋白質譜結果一致，在ox-LDL刺激下，PSRC1與ANXA2的結合明顯增加，且其結合具有特異性(圖2)。

表1 與PSRC1結合上調的蛋白基本信息Tab.1 Basic information of upregulated proteins binding to PSRC1

2.2 RAW264.7巨噬細胞過表達PSRC1對ANXA2細胞外分泌的影響 E LI S A 檢測結果顯示，與對照組比較，ox-LDL組ANXA2的水平明顯升高[(2027.23±93.55) pg/mlvs. (697.01±30.08) pg/ml，P<0.01，圖3A]；與Ad-GFP+ox-LDL組比較，Ad-PSRC1+ox-LDL組A NX A2的水平明顯降低[(1061.65±68.52) pg/mlvs. (2098.67±318.41) pg/ml，P<0.01，圖3B)。

2.3 PSRC1與ANXA2的細胞內共定位情況 免疫熒光染色后對細胞切片進行共聚焦觀察發現，ANXA2與PSRC1在細胞內存在明顯的共定位現象(圖4)。

2.4 腺病毒Ad-shANXA2對ANXA2的敲低效果RT-qPCR檢測結果顯示，與Ad-GFP組比較，AdshANXA2組ANXA2 mRNA的表達水平明顯降低(0.198±0.065vs. 1.002±0.069，P<0.05)。

2.5 ANXA2敲低后對主動脈大體及主動脈根部斑塊面積的影響 油紅O染色結果顯示，普通飲食與高脂飲食喂養小鼠主動脈產生部分AS斑塊，普通飲食+Ad-shANXA2組與普通飲食+Ad-GFP組的斑塊面積百分比差異無統計學意義(2.08%±0.16%vs.2.01%±0.10%，P>0.05，圖5A)，而與高脂飲食+Ad-GFP組比較，高脂飲食+Ad-shANXA2組斑塊面積百分比明顯減少(5.29%±1.14%vs. 12.28%±2.48%，P<0.05，圖5B)。顯微鏡下觀察發現，普通飲食+AdshANXA2組主動脈根部斑塊面積百分比與普通飲食+Ad-GFP組比較差異無統計學意義(0.80%±0.02%vs. 0.79%±0.02%，P>0.05，圖6A)，而高脂飲食+Ad-shANXA2組主動脈根部斑塊面積百分比與高脂飲食+Ad-GFP組比較明顯降低(1.31%±0.04%vs.2.83%±0.22%，P<0.05，圖6B)。

2.6 ANXA2敲低對APOE-/-小鼠血清炎性因子IL-1β、IL-6釋放的影響 由于普通飲食兩組小鼠斑塊差異并無統計學意義，而高脂飲食兩組小鼠的斑塊面積差異有統計學意義，因此進一步在高脂飲食兩組小鼠中進行炎性因子檢測，結果發現與高脂飲食+Ad-GFP組比較，高脂飲食+Ad-shANXA2組小鼠血清IL-1β[(122.90±9.80) pg/mlvs. (172.90±21.83) pg/ml]及IL-6水平[(3.65±0.12) pg/mlvs. (5.97±0.42) pg/ml]均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

AS與血脂代謝紊亂及免疫炎癥息息相關[6-7]。自從21世紀人類基因圖譜公布以后，Samani等[8]發表了全基因組關聯研究(Genome-Wild Association Studies，GWAS)，證實PSRC1基因表達水平與冠心病的發生有關。有研究發現，PSRC1基因表達水平升高可引起HDL-C水平升高、LDL-C水平降低，從而使患冠心病的風險降低[9]。除影響血脂水平外，PSRC1基因還可調節人體對他汀類藥物治療的反應性[10]。以上研究結果表明，PSRC1與脂質代謝紊亂有關，并可通過調節血脂來影響AS的發生發展過程。PSRC1不僅可影響血脂，還可能與炎癥反應有關[9]。本課題組前期研究結果提示，PSRC1的表達可能與AS的發生發展有關[5]，但具體作用及機制并不完全明了。因此，本課題組前期通過腺病毒轉染RAW264.7巨噬細胞觀察了PSRC1過表達對泡沫細胞形成的影響，并通過尾靜脈注射腺病毒，使ApoE-/-小鼠全身過表達PSRC1基因，觀察其對AS發生發展的影響，結果發現過表達PSRC1可通過抑制APOE-/-小鼠的炎癥反應及影響血脂代謝而抑制A S的進展，但其確切的分子機制尚不明確。為了尋找能與PSRC1結合的蛋白，本研究進行了非標記定量蛋白質組學分析，發現在RAW264.7巨噬細胞過表達PSRC1后，再用ox-LDL刺激，PSRC1與一種名為ANXA2的蛋白結合最多，且與蛋白質譜Co-IP及免疫熒光檢測的結果一致。

圖1 非標記定量蛋白質組學鑒定與PSRC1相互作用的蛋白Fig.1 Label free quantitative proteomics identification of proteins interacting with PSRC1

圖2 免疫共沉淀驗證PSRC1與ANXA2的結合Fig.2 Co-immunoprecipitation to verify the binding of PSRC1 and ANXA2

圖3 RAW264.7巨噬細胞過表達PSRC1對培養上清中ANXA2水平的影響Fig.3 ANXA2 in RAW264.7 supernatant after over-expression of PSRC1 (ELISA)

圖5 普通飲食或高脂飲食喂養+病毒轉染apoE-/-小鼠主動脈大體標本油紅O染色Fig.5 Aortas of apoE-/- mice under standard rodent chow or high-fat diet transfected with adenovirus (Oil red O staining)

圖6 普通飲食或高脂飲食喂養+病毒轉染apoE-/-小鼠主動脈根部切片油紅O染色(×400)Fig.6 Aortic root tissue of apoE-/- mice under standard rodent chow or an high-fat diet transfected with adenovirus (Oil red O staining,×400)

ANXA2是膜聯蛋白家族(Annexins)的成員之一，其主要特點為能夠與鈣離子結合，從而參與一系列依賴于鈣離子的生物膜轉運過程。ANXA2廣泛存在于身體各個部位，但不同組織與細胞中的ANXA2含量相差甚遠。在組織水平上，ANAX2在肺、胰腺、腎上腺等組織中高表達，在肝臟及腎臟組織中低表達；在細胞水平上，ANAX2在單核細胞及巨噬細胞中高表達[11]。此外，ANXA2廣泛存在于細胞核、細胞質及細胞外，既能在細胞內發揮胞膜相關的生理功能，又能釋放至胞外發揮作用。研究表明，細胞膜上的ANXA2可作為受體與纖溶酶原結合，并使其與組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)結合，促進纖溶酶的形成[12-13]。此外，ANXA2還可促進腫瘤細胞的遷移及新生血管的形成[12]。而在AS的發生發展中，ANXA2所扮演的角色尚未明確。有研究發現，在肝臟細胞胞膜上，ANXA2可與前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)結合，抑制PCSK9對低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)的降解[14-15]。然而，也有研究發現，ANXA2可介導基質金屬蛋白酶9(metalloproteinase-9，MMP-9)的釋放，他汀類藥物則能夠通過抑制ANXA2的表達減少MMP-9的釋放，穩定粥樣硬化斑塊[16]。此外，Wang等[17]研究發現，ANXA2可介導AS斑塊處巨噬細胞的遷移，并增加炎性因子的釋放，促進炎癥反應。Swisher等[18-19]發現，胞外的ANXA2可與巨噬細胞表面的TLR4受體結合，促進巨噬細胞釋放IL-1β、IL-6及TNF-α。因此，我們推測PSRC1過表達可抑制巨噬細胞炎癥反應，可能是因為ANXA2與PSRC1的結合增加，從而改變了下游炎癥信號通路所致。

為明確PSRC1對ANXA2的影響，本研究在細胞水平進行了探討，以ox-LDL刺激RAW264.7巨噬細胞后，采用ELISA試劑盒檢測培養上清中ANXA2含量，發現巨噬細胞釋放的ANXA2增加，而過表達PSRC1后再用ox-LDL刺激，與Ad-GFP組比較，巨噬細胞培養上清中的ANXA2明顯減少，提示PSRC1對ox-LDL誘導的ANXA2釋放起負調控作用。隨后本研究在動物水平進行了分析，構建了小鼠AS模型并用腺病毒尾靜脈注射以敲低小鼠體內的ANXA2水平，結果發現抑制ANXA2的表達可明顯減少斑塊面積，且可降低血清中炎性因子IL-1β、IL-6的水平。

綜上所述，本研究結果證實PSRC1可通過與ANXA2結合而抑制ANXA2的細胞外釋放，進而抑制炎癥反應，并最終延緩AS的進展，為AS的發病機制提供了新的理論依據，也為AS的抗炎治療提供了新靶點。后續可通過構建PSRC1-/-ANXA2-/-雙敲除小鼠模型來進行PSRC1敲除情況下的驗證。