高齡妊娠對子代大鼠海馬甲基化水平的影響

潘亞男，韓慰，楊靜，程莉，蔣莉*

1重慶醫科大學附屬兒童醫院神經內科/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014；2認知發育與學習記憶障礙轉化醫學重慶市重點實驗室，重慶 400014；3重慶醫科大學附屬兒童醫院兒科研究所，重慶 400014

高齡妊娠指女性妊娠年齡≥35歲。隨著二胎政策的開放、女性受教育程度的提高，以及輔助生殖技術的發展，女性生育年齡呈不斷推遲的趨勢。高齡父母的不良妊娠結局發生率不斷增高，其子代在遠期患自閉癥、精神分裂癥、抑郁等神經精神疾病的風險也會增高[1-2]。我國一項大型CEPS數據研究發現，高齡母親生育的青少年在學習成績、認知能力及健康狀況方面的表現均較差[3]。本課題組前期通過動物模型研究發現，高齡妊娠子代存在社會交往障礙、焦慮抑郁情緒及學習能力下降[4]；高齡妊娠子代海馬神經細胞增殖減少、遷移障礙，神經干細胞向神經元及星形膠質細胞分化異常，但具體機制尚不清楚[5]。DNA甲基化是目前研究最為深入的表觀遺傳調控機制之一，在神經系統發育及成熟過程中發揮重要作用。因此，本研究通過構建高齡妊娠和適齡妊娠子代動物模型，檢測并比較子代不同年齡段DNA甲基化的相關指標，觀察高齡妊娠對子代海馬甲基化的影響，旨在進一步探討高齡妊娠子代腦功能障礙的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 SPF級健康12月齡及3月齡雌性Sprague Dawley(SD)大鼠各10只、3月齡雄性SD大鼠10只由重慶醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(渝)2018-0003]，于SPF級動物實驗室中飼養，給予標準飼料，自由攝食、攝水，室內溫度20～25 ℃，明暗周期12 h/12 h。動物實驗符合重慶醫科大學附屬兒童醫院實驗動物倫理委員會制定的倫理標準。DNA甲基轉移酶(Dnmt)1兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體、HRP標記的β-actin小鼠IgG抗體購自成都正能生物技術有限公司，Dnmt3A兔多克隆抗體、Dnmt3B兔多克隆抗體購自美國Genetex公司，5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)小鼠單克隆抗體購自英國Abcam公司，山羊抗小鼠IgG二抗(DyLight 549)購自亞科因武漢生物技術有限公司，DAPI購自北京雷根生物技術有限公司，PCR引物購自中國生工生物工程(上海)股份有限公司，RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑購自日本TaKaRa公司，ECL發光液購自美國Bio-Rad公司，DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，DNA甲基化定量檢測試劑盒購自美國Epigentek公司。

1.2 分組及標本收集 高齡雌鼠(12月齡)與雄鼠(3月齡)交配產下的子代為高齡子代組(AMA組)，適齡雌鼠(3月齡)與雄鼠(3月齡)交配產下的子代為適齡子代組(對照組)。在生后第7、14、28天對兩組子代大鼠進行處理，取大腦全腦與海馬組織。

1.3 Western blotting檢測海馬Dnmts蛋白表達水平 AMA組與對照組每個時間點各8只子鼠，取單側海馬進行實驗。麻醉后斷頭取腦，冰上分離海馬，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。用10%的分離膠、5%的濃縮膠電泳，然后將蛋白電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗(Dnmt1，1:1000；Dnmt3A，1:2000；Dnmt3B，1:1000；β-actin，1:1000)，4 ℃冰箱孵育過夜。TBST洗膜后加入HRP標記的二抗(1:5000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，ECL發光顯影。采用Image Lab軟件分析灰度值，蛋白質相對表達水平以Dnmts/β-actin的比值表示。

1.4 實時熒光定量PCR檢測海馬Dnmts mRNA表達水平 AMA組與對照組每個時間點各8只子鼠，取單側海馬進行實驗。按照試劑盒說明書步驟提取子鼠海馬組織RNA，利用TaKaRa反轉錄體系將RNA反轉錄成cDNA。采用Nanodrop分光光度計檢測cDNA濃度。反應體系：正反向引物各0.2 μl，cDNA模板40 ng，SYBR Premix Ex Taq 5 μl，加蒸餾水至總體積10 μl。擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，最佳退火溫度退火30 s(Dnmt1 62.1 ℃，Dnmt3A 59.3 ℃，Dnmt3B 59.0 ℃)，擴增39個循環。以β-actin為內參照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 免疫熒光檢測海馬5-mC的表達 AMA組與對照組每個時間點各8只子鼠，取全腦進行實驗。子鼠麻醉后予以0.9%氯化鈉溶液灌注，4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取全腦置于4%多聚甲醛中，于4 ℃冰箱中固定24 h。先后在15%和30%蔗糖溶液中脫水沉底，OCT冰凍切片包埋劑包埋，冠狀位切片(30 μm)保存于冰凍保護液中。貼片后置于枸櫞酸鹽修復液(pH=6.0)中95 ℃水浴加熱15 min，0.3%Triton-X-100浸泡15 min，10%BSA+0.3 mol/L甘氨酸溶液室溫封閉1 h。加入5-mC一抗(1:100) 4 ℃孵育24 h。室溫下復溫1 h。加入二抗(1:250)避光室溫孵育3 h，DAPI(1:2000)染核20 min，滴加抗熒光淬滅劑，封片。在90I熒光顯微鏡下觀察拍攝，并用NIS-Viewer軟件分析熒光強度。

1.6 ELISA法檢測海馬5-mC的表達 AMA組與對照組每個時間點另取5只子鼠，取單側海馬進行實驗。按照DNA提取試劑盒說明書步驟提取子鼠海馬組織DNA，Nanodrop分光光度計測定DNA濃度。按照DNA甲基化定量檢測試劑盒說明書步驟進行檢測。在波長450 nm處檢測吸光度值，根據公式計算5-mC含量。

1.7 統計學處理 采用GraphPad Prism 8軟件進行統計分析。計量資料以表示，組間數據比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組子代海馬Dnmts 蛋白的表達情況Western blotting檢測結果顯示，生后第7天，AMA組Dnmt3A蛋白表達明顯高于對照組(1.02±0.13vs. 0.85±0.13，P<0.05)；生后第14天，兩組間Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B蛋白表達差異均無統計學意義(P>0.05)；而生后第28天，AMA組Dnmt1、Dnmt3A蛋白表達明顯低于對照組(0.34±0.10vs.0.43±0.05；0.66±0.20vs. 0.91±0.22，P<0.05)(圖1)。

圖1 高齡妊娠對子代大鼠海馬Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B蛋白表達的影響Fig.1 Advanced pregnancy affects the expressions of Dnmt1, Dnmt3A and Dnmt3B protein in hippocampus of offspring rats

2.2 兩組子代海馬Dnmts mRNA的表達情況 實時熒光定量PCR檢測結果顯示，生后第7、14天，兩組Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；生后第28天，AMA組Dnmt1 mRNA表達明顯低于對照組 (0.82±0.16vs.1.11±0.31，P<0.05)(圖2)。

圖2 高齡妊娠對子代大鼠海馬Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B mRNA表達的影響Fig.2 Advanced pregnancy affects the expressions of Dnmt1, Dnmt3A and Dnmt3B mRNA in hippocampus of offspring rats

2.3 免疫熒光檢測海馬5-mC的定位及表達情況海馬免疫熒光染色可見5-mC表達于大鼠海馬細胞核內，在DG、CA1、CA3區均有表達。DG區細胞排列致密，CA3區細胞排列相對稀疏，DG區5-mC表達明顯強于CA3區。生后第7、14天，AMA組熒光強度高于對照組，兩組間差異有統計學意義(906.42±37.97vs. 839.36±59.60，951.92±41.53vs.906.93±37.88，P<0.05，圖3)。

圖3 高齡妊娠對子代大鼠海馬5-mC表達的影響Fig.3 Advanced pregnancy affects the expression of 5-mC in hippocampus of offspring rats

2.4 ELISA法檢測海馬5-mC的表達水平 ELISA檢測結果顯示，生后第7、14、28天，AMA組海馬5-mC的表達水平高于對照組，但兩組間差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 兩組子代大鼠海馬5-mC表達水平比較(%, ±s, n=5)Tab.2 Comparison of the 5-mC expression levels in hippocampus of offspring rats (%, ±s, n=5)

表2 兩組子代大鼠海馬5-mC表達水平比較(%, ±s, n=5)Tab.2 Comparison of the 5-mC expression levels in hippocampus of offspring rats (%, ±s, n=5)

組別 第7天 第14天 第28天對照組 1.34±0.32 1.34±0.13 1.42±0.24 AMA組 1.57±0.19 1.45±0.21 1.81±0.33 t 1.3580 0.9847 2.1570 P 0.2115 0.3536 0.0631

3 討 論

高齡妊娠所致子代神經精神障礙及認知發育問題越來越受到關注。眾所周知，海馬與個體學習、記憶、情緒調節等功能密切相關，且海馬部位神經干細胞的成熟、遷移、分化是大腦結構及功能的基礎。本課題組前期研究發現，高齡妊娠可明顯抑制未成熟腦海馬區的神經發生，其機制尚不明確[5]。已有研究發現，表觀遺傳修飾在神經發生的不同階段均具有重要作用，DNA甲基化參與了多種神經精神疾病的發病機制[6]。為此，本研究通過構建高齡妊娠和適齡妊娠子代動物模型，對比觀察高齡妊娠是否影響子代海馬的甲基化水平，以探索海馬DNA甲基化是否與高齡妊娠子代神經發生異常相關。

DNA甲基化主要指在CpG二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子上增加一個甲基基團形成5-mC。Dnmts家族是DNA甲基化形成的重要媒介，其中Dnmt1、Dnmt3具有催化作用，分別對復制過程中新合成的DNA子鏈以及完全未經修飾的DNA雙鏈進行甲基化修飾[7]。由于腦發育過程伴隨著Dnmts在大腦海馬的分布定位及表達水平改變[8]，因此，本實驗檢測了AMA組與對照組子鼠生后第7、14、28天(腦發育水平相當于人類新生兒期、嬰兒期及幼年期)海馬Dnmt1、Dnmt3A、Dnmt3B蛋白及mRNA的表達水平。結果顯示，生后第7天，AMA組海馬Dnmt3A蛋白表達較對照組明顯升高，生后第28天，AMA組海馬Dnmt1 mRNA及Dnmt1、Dnmt3A蛋白表達較對照組均明顯降低，提示高齡妊娠可影響子代海馬Dnmts的表達，高齡妊娠子代存在海馬DNA甲基化異常。有研究發現，Dnmts家族參與了神經干細胞自我更新、細胞分化及成熟的過程[9]。Dnmt3A參與調控神經祖細胞向神經元或神經膠質細胞的定向分化，而Dnmt3B可促進神經祖細胞分化，抑制其增殖[8,10]；條件性敲除Dnmt1基因可導致神經祖細胞提前向星形膠質細胞分化[11]。本課題組前期研究發現，高齡妊娠子代生后第7天，海馬神經干細胞增殖標志物Nestin蛋白及遷移標志物Dcx蛋白表達水平明顯降低；生后第28天，海馬成熟神經元標志物NeuN表達水平升高，星形膠質細胞標志物GFAP表達水平明顯降低，提示子代海馬神經發生異常[5]，高齡妊娠可能通過干擾子代海馬Dnmts表達影響DNA甲基化修飾，進而影響子代神經發生。此外，Dnmts突變可導致大腦結構或功能損傷。有研究發現，Dnmt3A基因敲除的胚胎在發育成熟后可出現神經系統功能異常、運動障礙；Dnmt1及Dnmt3A基因敲除小鼠的突觸可塑性受損[12]。另一項研究發現，Dnmt1基因突變可導致遺傳性感覺神經病伴癡呆及聽力障礙[13]。

目前認為，DNA甲基化在外界環境的影響下可發生動態改變[14]。高齡雌鼠卵巢功能下降，子宮和胎盤功能減退[15-16]。有研究發現，高齡雌鼠胚胎多個基因啟動子區域甲基化水平異常，著床前胚胎甲基化水平低于適齡雌鼠[17-18]。因此，母親高齡可能是影響子代甲基化水平的因素之一。本研究進一步比較了AMA組與對照組海馬5-mC的表達情況，發現生后第7、14天，AMA組海馬5-mC表達量較對照組明顯增加，提示AMA組海馬整體DNA甲基化水平升高。Western blotting檢測結果顯示，AMA組雖然生后第14、28天時Dnmts表達降低，但整體DNA甲基化水平仍高于對照組。這可能與DNA甲基化水平受多方面因素影響有關。DNA甲基化水平是甲基化形成和去甲基化動態平衡的結果。Dnmts主要介導甲基化形成過程。近年來發現的去甲基化酶(TET酶)可介導5-mC逐步氧化還原，經過胸苷嘧啶DNA糖基化酶(TDG)酶切除逆轉為未經修飾的胞嘧啶[19-20]，從而降低甲基化水平。此外，DNA甲基化水平可能還受到DNA復制速率等因素的影響[21]。甲基化水平與疾病的關系較為復雜，目前尚不能明確高齡妊娠子代海馬的高甲基化狀態會對腦發育產生何種影響。結合DNA甲基化的作用主要是抑制基因表達，本課題組前期研究證實生后第14、28天，AMA組海馬腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達減少[4]。方金[22]的研究也發現，生后第7天高齡妊娠子代海馬區與神經細胞增殖相關的Skp mRNA明顯低于適齡妊娠子代；高齡妊娠組成年子代海馬Edn1和Hspa1基因表達減少，前者具有類神經遞質功能，后者與海馬依賴的空間學習記憶有關。在大腦發育的關鍵期，海馬高甲基化狀態可能通過抑制神經營養因子、轉錄激活因子等蛋白的表達而干擾神經發生，進而影響海馬的結構或功能，導致子代認知發育障礙。

已有研究發現，多種神經精神疾病存在DNA甲基化水平異常升高[23]。精神分裂癥患者的血液及邊緣性人格障礙患者的唾液中BDNF啟動子區域甲基化水平升高[24]；抑郁患者BDNF、5-羥色胺轉運體基因的啟動子呈高甲基化狀態[25]；癲模型大鼠海馬的整體甲基化水平升高[26]。鑒于DNA甲基化具有可調控性，改善疾病的高甲基化狀態可以輔助疾病治療。研究發現，抗抑郁藥物治療后抑郁癥患者血液中BDNF啟動子區域甲基化水平明顯下降[27]；以氮雜胞苷及地西他濱為代表的Dnmts抑制劑已被美國FDA批準用作表觀遺傳修飾治療的一線藥物，應用于血液系統惡性腫瘤的治療[28-29]。

綜上所述，本研究結果驗證了高齡妊娠可引起子代海馬甲基轉移酶表達異常，生后腦發育關鍵期DNA甲基化水平升高。探索高齡妊娠子代DNA甲基化異常有助于對高齡子代腦功能障礙發生機制的深入研究，并為針對性改善其子代腦功能障礙提供干預的方向。