SOX9腺病毒過表達載體的構建及其對犬ADSCs向胰島樣細胞分化的影響

高登科，戴鵬秀，范志新，張 霞，阮晨梅，王璟璐，張欣珂，張翊華

(西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100)

糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤之后危害人和動物身體健康的第三大疾病，是犬常見的高發內分泌疾病，患病犬通常會出現高血糖和糖尿，并表現出多飲、多尿、多食和體重減輕等臨床癥狀[1]。雖然外源性胰島素治療可以控制糖尿病的血糖升高，但無法防止血糖波動引起的微血管病變及并發癥[2]。胰島移植是治療胰島素依賴性糖尿病的理想方法，但因供體缺乏和免疫排斥而受阻[3]。因此，尋找一種更加高效、安全的糖尿病治療方法是目前醫學亟待解決的問題。

脂肪間充質干細胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)具有多向分化潛能，其不僅來源廣泛，易于分離培養，而且移植后免疫原性低，對受體的淋巴細胞還具有免疫抑制能力，是治療自身免疫損傷性糖尿病的理想種子細胞[4]。SOX9是內胚層發育和分化時期胰腺祖細胞的標志物之一，其對于維持胰腺祖細胞狀態是必需的。McDonald等[5]研究發現，人胚胎胰島上皮細胞敲除SOX9基因后胰島素陽性細胞大量丟失，隨后進一步試驗發現，SOX9是以劑量依賴的方式調控祖細胞擴增、β細胞分化的，并且SOX9基因的表達量可以反映胰島細胞增殖能力。但到目前為止，SOX9在ADSCs向胰島樣細胞分化過程中是否具有重要作用還是一個未知數。因此，本試驗構建了腺病毒過表達重組載體pAdTrack-SOX9-AdEasy，并用獲得了具有感染性的腺病毒毒液感染犬ADSCs ； 隨后通過檢測感染后的綠色熒光蛋白表達情況、細胞形態變化和胰島β細胞發育相關基因的表達情況，探討SOX9基因的過表達對犬ADSCs向胰島樣細胞分化的影響和意義，為進一步獲得有功能的胰島β細胞提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 犬ADSCs由陜西省干細胞工程技術研究中心分離、鑒定和保存[6]；293A細胞由西北農林科技大學動物醫學院外科實驗室保存；pAdTrack-CMV、Stbl3、BJ5183-AD-1，均購自北京華越洋生物科技有限公司；EasyGeno快速重組克隆試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；BglⅡ酶、Hind Ⅲ酶、PacI酶、PmeI酶，均購自New England Biolabs公司；Advanced Transfection Reagent，購自ZETA LIFE公司。

1.2 pAdTrack-CMV-SOX9的構建 通過全基因組合成技術，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成SOX9基因的CDS序列(SOX9 Gene ID:403464)，設計引物：SOX9-1F、SOX9-1R(表1，上、下游引物與腺病毒表達載體pAdTrack-CMV的BglⅡ、Hind Ⅲ 處分別有20 bp的重疊區域)。PCR擴增SOX9基因，pAdTrack-CMV經BglⅡ和Hind Ⅲ 雙酶切，經過膠回收和測序鑒定，得到SOX9基因片段和線性化載體。根據EasyGeno快速重組克隆試劑盒說明書連接SOX9基因片段和線性化載體。連接產物經Stbl3感受態細胞轉化后，進行質粒的提取，對得到的質粒pAdTrack-CMV-SOX9進行PCR和雙酶切鑒定。

1.3 重組腺病毒質粒的制備和腺病毒的包裝與檢測 pAdTrack-CMV-SOX9、pAdTrack-CMV經PmeⅠ單酶 切線性化后，于BJ5183-AD-1感受態細胞(含有質粒pAdeasy-1)中進行重組。對得到的質粒pAdTrack-SOX9-AdEasy、pAdTrack-0-AdEasy使用PacⅠ單酶切鑒定，回收鑒定正確的線性化片段。按照Advanced Transfection Reagent說明書于293A細胞中轉染，獲得第1代腺病毒毒液，再次感染293A細胞，以大量擴增腺病毒，對第4代腺病毒毒液滴度進行測定。利用特異性引物SOX9-2F、SOX9-2R和GADPH-F、GADPH-R(表1)對感染pAdTrack-SOX9-AdEasy、pAdTrack-0-AdEasy的293A細胞及未感染的293A細胞進行目的基因的實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測。

1.4 體外培養犬ADSCs向胰島樣細胞分化及相關基因的RT-qPCR檢測 第3代犬ADSCs以1×105個/mL 接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞長至60%，按感染復數(MOI)等于100進行感染，37 ℃、5% CO2培養箱孵育1 h后，加入500 μL含10% FBS的α-MEM培養基；在感染4、7、10、13 d和16 d后，倒置熒光顯微鏡下觀察犬ADSCs中綠色熒光蛋白的表達情況以及細胞的形態變化，并分別進行細胞樣品的收集。通過Primer Premier 6.0對Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD1、Pax4、Gata4、PCSK1、PCSK2、Insulin等進行引物設計(表1)，進行RT-qPCR檢測。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結果

2.1 pAdTrack-CMV-SOX9載體的構建 利用PCR技術，獲得含有BglⅡ和Hind Ⅲ特定酶切位點的SOX9基因片段(1 582 bp，圖1A)，經測序驗證SOX9基因片段擴增正確。將得到的SOX9片段與線性化載體pAdTrack-CMV連接，得到pAdTrack-CMV-SOX9質粒，經過BglⅡ和Hind Ⅲ 雙酶切和PCR鑒定(圖1B)，結果均與預期大小相符，成功構建pAdTrack-CMV-SOX9載體。

2.2 腺病毒過表達重組載體的構建 線性化載體pAdTrack-CMV-SOX9、pAdTrack-CMV于BJ5183-AD-1感受態細胞中重組，分別獲得pAdTrack-SOX9-AdEasy和pAdTrack-0-AdEasy。經PacI單酶切鑒定，均得到大小約為30 kb和5 kb的2條條帶(圖1C)，證明成功構建腺病毒過表達重組載體pAdTrack-SOX9-AdEasy和pAdTrack-0-AdEasy。

圖1 pAaTrack-CMV-SOX9重組腺病毒載體的構建Fig.1 Construction of recombinant adenovirus vector pAaTrack-CMV-SOX9A：SOX9基因的克隆(M：1 kb plus DNA marker； 1：SOX9基因片段)； B：pAdTrack-CMV-SOX9載體的鑒定(M：D15 000 DNA marker；1：pAdTrack-CMV雙酶切產物； 2：pAdTrack-CMV-SOX9雙酶切產物； 3：SOX9 PCR擴增產物)； C：重組腺病毒表達載體Pac I酶切鑒定(M：D15 000 DNA marker； 1：pAdTrack-SOX9-AdEasy Pac I酶切產物； 2：pAdTrack-0-AdEasy Pac I酶切產物)A:Clone of the SOX9 gene (M:1 kb plus DNA marker; 1:SOX9 gene fragments); B:Identification of pAdTrack-CMV-SOX9 vector (M:D15 000 DNA marker; 1:pAdTrack-CMV bienzyme cutting products; 2:pAdTrack-CMV-SOX9 bienzyme cutting products; 3:SOX9 PCR amplification products); C:Recombinant adenovirus expression vector Pac I enzyme identcfication (M:D15 000 DNA marker;1:pAdTrack-SOX9-AdEasy Pac I enzyme cut products; 2:pAdTrack-0-AdEasy Pac I enzyme cut products)

2.3 腺病毒的包裝、滴度測定和過表達效果檢測PacI單酶切pAdTrack-SOX9-AdEasy、pAdTrack-0- AdEasy，回收線性化產物分別轉染至293A細胞中，24 h后可觀察到綠色熒光蛋白表達，48 h后滿視野細胞均可見綠色熒光表達(見中插彩版圖2A～2D)。持續培養6～7 d后，獲得第1代腺病毒毒液，經過擴增，對第4代腺病毒毒液進行滴度測定，SOX9基因過表達腺病毒毒液滴度為5.375×1010TU/mL， 空載體腺病毒毒液滴度為5.875×1010TU/mL。 將2個腺病毒毒液感染293A細胞，SOX9過表達腺病毒組的SOX9基因表達水平(20 797.35 ±3 543.34)相對于陰性對照(1±0.059 9)和空載體對照(1.822 9±0.004 2)升高極顯著(P<0.001，見中插彩版圖2E)，表明成功獲得SOX9基因過表達腺病毒毒液。

圖2 腺病毒表達載體的包裝及過表達效果檢測Fig.2 Adenovirus expression vector packaging and overexpression effect detectionA、B：SOX9基因腺病毒表達載體在293A細胞中包裝24 h、48 h熒光圖(100×)； C、D：空載體腺病毒在293A細胞中包裝24 h、48 h熒光圖(100×)； E：SOX9基因在293A細胞內相對表達量；與pAdTrack-0-AdEasy組比較，***： P<0.001A、B:SOX9 gene adenovirus expression vector in 293A cells packaging 24 h,48 h fluorescence map(100×); C、D:Empty carrier adenovirus in 293A cells packaging 24 h,48 h fluorescence map(100×); E:Relative expression of SOX9 gene in 293A cell；Compare to the pAdTrack-0-AdEasy group,***: P<0.001

2.4 腺病毒毒液感染犬ADSCs效果觀察 使用SOX9基因過表達腺病毒感染犬ADSCs，感染4 d后觀察到有綠色熒光蛋白表達，熒光強度較弱(見中插彩版圖3A1、3a1)；感染7 d后細胞開始變圓，熒光強度增強(見中插彩版圖3A2、3a2)；感染10 d后大部分細胞分化變圓，熒光表達情況依然很好(見中插彩版圖3A3、3a3)；感染13 d后細胞開始出現聚集生長，胰島樣細胞團出現，同時隨著細胞增殖，腺病毒被稀釋出現衰減，熒光開始減弱(見中插彩版圖3A4、3a4)；感染16 d后胰島樣細胞團數量增加，只有個別細胞出現熒光(見中插彩版圖3A5、3a5)。空載體腺病毒毒液感染犬ADSCs后的熒光情況與SOX9基因過表達腺病毒毒液感染犬ADSCs的情況相似(見中插彩版圖3B1～3B5、3b1～3b5)，并在13 d時細胞開始出現死亡，但未出現成團現象。以上結果表明，SOX9基因過表達腺病毒毒液感染犬ADSCs后，提高了犬ADSCs向胰島樣細胞分化的效率。

圖3 腺病毒毒液感染犬ADSCs的熒光鑒定(100×)Fig.3 Fluorescence identification of adenovirus venom infection canine ADSCs (100×)A1～A5/a1～a5：SOX9基因過表達腺病毒毒液感染犬ADSCs后第4、7、10、13天和第16天的明場圖/熒光圖，紅色箭頭所指為胰島樣細胞團； B1～B5/b1～b5：空載體腺病毒毒液感染犬ADSCs后第4、7、10、13天和第16天的明場圖/熒光圖A1～A5/a1～a5:The bright field images and fluorescence images of SOX9 overexpressed adenovirus venom infected canine ADSCs on day 4,7,10,13 and 16,the red arrow refers to islet-like cell clusters; B1～B5/b1～b5:The bright field images and fluorescence images of empty carrier adenovirus venom infected canine ADSCs on day 4,7,10,13 and 16

2.5 體外培養犬ADSCs向胰島樣細胞分化相關基因的RT-qPCR檢測 為進一步檢測SOX9基因在犬ADSCs向胰島樣細胞分化中的作用，進行了相關基因的表達水平檢測。如中插彩版圖4所示，SOX9腺病毒感染犬ADSCs后，Pdx1、MafA、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2的轉錄水平顯著上升，分別高達陰性對照的316.77、183.19、651.58、27.71倍和51.45倍；并且Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Pax4和Gata4的轉錄水平也均較空載體腺病毒感染細胞小幅度上升。此外，從誘導時間上看，短期(4、7 d和10 d)感染情況下，SOX9腺病毒可通過外源性刺激提高Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Gata4和PCSK1的基因轉錄水平，從而影響犬ADSCs向胰島樣細胞的分化過程。在腺病毒感染犬ADSCs后第13天或第16天時，SOX9的外源性刺激作用逐漸減弱，然而一些基因表達水平仍很高。特別是SOX9腺病毒感染第16天時Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2的mRNA水平仍接近最高水平，說明SOX9長期刺激后可通過影響Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2的內源性轉錄進而調控犬ADSCs向胰島樣細胞的分化。

圖4 胰島發育相關基因的RT-qPCR檢測結果Fig.4 RT-qPCR test results of genes related to islet developmentA/B：SOX9基因過表達/空載體腺病毒毒液感染犬ADSCs后分別在4、7、10、13 d和16 d檢測相關基因的mRNA表達量；*:P<0.05，有統計學差異；**:P<0.01，有顯著統計學差異；***:P<0.001，有極其顯著的統計學差異A/B：The test results of the relevant gene mRNA expression respectively on the 4th,7th,10th,13th,16th days after canine ADSCs were infected with SOX9 gene overexpression/empty carrier adenovirus venom；*:P<0.05,statistical differences;**:P<0.01,significant statistical differences;***:P<0.001,extremely significant statistical differences

3 討論

胰島β細胞替代治療作為一種非常有前景的治療方法正受到越來越多的關注。ADSCs具有來源豐富、易分離、易擴增和無倫理學爭議等優點，成為誘導分化成β細胞的重要種子細胞資源。而且，與其他間充質干細胞相比，ADSCs中含有瘦素、脂肪細胞因子、內脂素等[7]，具有調節血糖平衡作用的生物活性物質。因此，ADSCs作為治療糖尿病的種子細胞來源更具有優勢。之前已有大量研究表明，ADSCs能夠定向誘導分化為胰島素分泌細胞(Insulin-producing cells，IPCs)，并且分化后的細胞具有降低血糖的功效，但得到IPCs的比例相對較低，且細胞分泌胰島素的功能仍有待完善[8-10]。腺病毒載體介導的細胞轉染技術相比于常規的物理和化學介導的細胞轉染方法具有較好的轉染效率，在感染復數(MOI)等于100時，感染率可達到70%，且對細胞增殖能力沒有顯著影響[11]。SOX9是控制生長發育基因家族SOX中的一員，屬于核轉錄因子，是胰腺發育過程調控網絡中的多潛能因子。研究表明，SOX9與Notch、Wnt、Fgf信號通路共同作用參與早期胰腺發育與晚期內分泌細胞分化，其功能缺失可以導致胰腺發育不全和祖細胞池枯竭[12]。Dubois等[13]研究發現，SOX9基因功能缺失可以導致小鼠血糖發生變化。但SOX9基因在ADSCs向胰島β細胞分化過程中是否具有重要作用還是一個未知數。因此，為探討SOX9基因在ADSCs向胰島樣細胞分化過程中的作用，本試驗將犬ADSCs多向分化潛能與腺病毒在基因傳遞過程中的優越性相結合，應用腺病毒攜帶SOX9誘導犬ADSCs向胰島樣細胞分化，觀察細胞形態變化。結果顯示，SOX9誘導犬ADSCs后在第13天和第16天出現了細胞聚集生長現象，且細胞團數不斷增加。這在一定程度上可以說明SOX9的誘導能有效促使犬ADSCs成團生長，促進犬ADSCs向胰島樣細胞分化。

近年來，胰腺發育相關基因在胰島β細胞發育成熟中的作用不斷被報道。其中，Pdx1基因在胚胎發育過程中能促進胰腺的早期發育和晚期胰島素分泌細胞分化，在成體中能幫助維持胰島β細胞的形態和功能，是β細胞的主要調控因子[14]。Ngn3主要在胚胎發育期的胰腺、神經管和下丘腦組織表達，是胚胎時期決定胰腺內分泌細胞命運的重要因子[15]。Mnx1編碼同源域轉錄因子，在背部胰腺原基中Pdx1的表達之前，于背側和腹側腸內胚層中表達[16]。MafA是一種胰島β細胞特異性轉錄因子，只在β細胞中調控胰島素基因的表達[17]。Nkx2.2是最初表達于發育時期胰腺胚芽的基因，其可促使胰腺祖細胞向內分泌細胞方向分化[18]。Nkx6.1對于胰腺β細胞形成非常重要，Nkx6.1突變胰腺成熟β細胞完全缺乏，而α細胞發育正常[19]。PCSK1和PCSK2編碼的前蛋白轉化酶1和2是胰島素原加工為胰島素的關鍵酶[20]。在本試驗中發現，SOX9誘導犬ADSCs后，在第16天時腺病毒雖然被稀釋衰減，但Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2等基因仍有較高的表達量，提示出現了內源性表達。NeuroD1、Pax4和Gata4的表達量較其他基因來說相對較低，這可能是由于SOX9的外源性刺激對這3個基因的影響較弱未能引起內源性表達；Insulin基因的不表達說明細胞仍未發育為成熟的胰島β細胞，而只是分化為胰島樣細胞，可能還需要其他因子的共同作用，具體原因還有待于進一步研究。

本試驗所構建的重組SOX9腺病毒提供了良好的轉基因工具，其轉染犬ADSCs能夠誘導Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2 等基因出現內源性表達，并能有效促進犬ADSCs成團生長，這為ADSCs進一步分化成為胰島素分泌細胞提供試驗依據。