超高效液相色譜-高分辨質譜定量檢測蜂毒衍生品中蜂毒肽的含量

蔡冬梅 傅 怡 張玉豪 孫菲菲 周金慧 楊宇暉 楊術鵬， 李 熠

（1.中國農業科學院蜜蜂研究所，農業農村部蜂產品質量安全控制重點實驗室，北京100093；2.安徽農業大學動物科技學院，合肥230036；3.中國農業科學院農產品加工研究所，北京100193）

蜂毒是由蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌的毒液，它是蜜蜂蜇刺敵害時釋放的一種生物武器。蜂毒中含有豐富的酶、多肽、生物胺、激素、有機酸、氨基酸等物質，其中蜂毒肽（蜂毒溶血肽）是蜂毒中主要成分，占蜂毒干重的50%以上[1]。蜂毒肽是由24個氨基酸組成的小肽類物質，其氨基酸序列為GIGAVLKVLTTGLPALI SWIKRKRQQ，其中6個親水性氨基酸殘基在C端，20個疏水性氨基酸殘基在N端，呈α－螺旋構象[2]。蜂毒肽具有廣泛且強烈的生物學活性，如抗菌、抗炎、鎮痛、免疫調節、抗病毒和抗腫瘤等功效[3～6]。目前，我國和全球多個國家均已批準蜂毒肽作為上市藥物，用于治療風濕性疾病和周圍神經炎。近年來研究發現，蜂毒肽在皮膚保養和皮膚病防治方面療效確切，它能刺激肌膚膠原蛋白產生，撫平細紋，恢復彈性，從而使得蜂毒肽成為護膚品行業的新寵[7]。目前，國內外已經有眾多企業開展了蜂毒肽在護膚品中應用探索，并在市場上推出了各式各樣的護膚產品，如蜂毒保濕水、蜂毒護膚霜、蜂毒面膜等。蜂毒產量非常稀少，從而導致蜂毒肽原料價格非常昂貴。護膚品中添加蜂毒肽會顯著增加生產成本，其價格顯著高于普通護膚品。當前，我國并未頒布有關護膚品等產品中蜂毒肽的含量測定標準，不同企業的生產方式和質控標準并不統一，從而導致市場上蜂毒肽類護膚品的質量參差不齊，甚至出現了假冒偽劣的現象。因此，對蜂毒肽的準確定量分析方法的開發已經成為養蜂業和護膚行業的共識。但由于蜂毒肽眾多衍生產品中蜂毒肽含量很低，僅處于痕量水平，而其基質又十分復雜，亟需開發一個可精確定量蜂毒肽含量的方法。

有關蜂毒肽的檢測方法主要是免疫分析和儀器分析。抗原抗體特異性識別是免疫分析方法的基礎，KING等[8]通過免疫小鼠，獲得蜂毒肽的多克隆抗體和單克隆抗體。但是作者并未基于獲得抗體開展定量分析方法開發。盡管免疫分析方法具有簡單、方便等優點，但是由于抗體存在制備周期長、定量方法結果準確度和穩定性差等弊端，限制了其在蜂毒肽定量中的應用。基于色譜的儀器分析在蜂毒肽定量分析方面有廣泛報道，也是當前蜂毒肽定量的主要檢測方法。早期報道的儀器分析方法主要基于高效液相色譜結合紫外檢測器（HPLC－UV），但是這類方法存在定量限高、準確度和精密度有限以及抗干擾能力差等弊端[9]。隨著液相色譜串聯質譜（LC－MS）技術的成熟與普及，LC－MS已經成為近10年來蜂毒肽的主要檢測方法。液相串聯三重四極桿質譜（LC－MS/MS）、液相串聯離子阱質譜（LC－IT）以及液相色譜串聯高分辨質譜（LC－HRMS）也相繼應用到各種基質中蜂毒肽的定量[10～14]。由于蜂毒肽的化學結構中含有24個氨基酸，采用LCMS檢測時，其離子化效率有限，從而導致建立方法的靈敏度依然有限[12～13]。此外，已報道的LCMS方法主要采用外標法進行定量分析，難以適用于眾多的蜂毒衍生品中蜂毒肽的準確定量[10～11，13]。近年來，隨著蛋白質組學和肽段合成技術的快速發展，基于LC－MS的靶向蛋白質定量技術取得了巨大突破。與直接檢測小肽相比，基于蛋白酶水解策略結合同位素標記特征性肽段的定量技術在方法的靈敏度、準確度、穩定性和方法實用性等方面具有顯著優勢。本研究擬采用該策略并結合UHPLCHRMS開展蜂毒衍生品中蜂毒肽的定量分析方法開發和有效性評價，為保護蜂毒肽消費者的權利提供方法支持，同時為后續蜂毒肽行業標準的制定提供方法參考。

一、材料與方法

（一）儀器與試劑

1.儀器與設備。超高效液相色譜串聯四極桿/高分辨靜電軌道阱質譜（UHPLC Q Executive Plus，美國Thermo Fisher Scientific公司）；臺式低溫離心機（Microfuge 22R Centrifuge，美國Beckman Coulter公司）；全波長酶標儀（Multiskan GO，美國Thermo Fisher Scientific公司）；電子分析天平（PL203，德國Mettlertoledo公司）；蒸發濃縮儀（Speed－Vacsvstem，RVC2－18， 德國MarinChrist公司）；超純水機（Milli－Q，美國Millipore公司）；超低溫冰箱（MDF－U3286S，日本SANYO公司）。

2.試劑與標準品。碳酸氫銨（NH4HCO3）購買于Solarbio公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、 二硫蘇糖醇（DL－dithiothreitol，DTT）、 碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA） 購于Sigma－Aldrich公司； 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）購于J.T.Baker公司；質譜級胰蛋白酶（trypsin） 購 自Promega（Madison，WI，USA） 公 司 ，甲酸（formic acid，FA）、 甲醇（methanol）、 乙腈（acetonitrile，ACN）購買于Fisher公司；C18除鹽洗脫柱購于3M公司（Minnesota Mining and Manufacturing）。

特征肽段VLTTGLPALISWIK；穩定同位素標記的內標（SIL－IS）肽段VLTTGLPALISWIK*（K*表示賴氨酸中的碳置換為13C，氮置換為15N）由南京源肽生物科技有限公司合成，純度≥98%，儲存在－20℃備用。

（二）樣本前處理方法

1.溶液配制。40 mM NH4HCO3溶液：稱取0.316 g NH4HCO3，用超純水定容100 mL，4℃冰箱保存待用。100 mM DTT：稱取DTT 308.5 mg，40 mMNH4HCO3溶液定容到20 mL，每管l mL分裝，－20℃冰箱保存待用。100 mM IAA溶液：稱取IAA 0.39 g，用40 mM的NH4HCO3溶液定容至20 mL，－20℃冰箱保存待用。活化液：500μL ACN、3μL TFA，超純水定容至1 mL，4℃保存。平衡液：1μL TFA，超純水定容至1 mL，存于4℃。洗脫液：800μL ACN、1μL TFA，超純水定容至1 mL，4℃保存。

2.樣本前處理方法。

（1）方法A：未酶切前處理方法。準確稱取蜂毒衍生品樣品1 g至10 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋溶解后，35℃氮吹至近干。加入1 mL去離子水渦旋復溶，于14 000 rpm 4℃條件下離心12 min。收集上清液于新的2 mL離心管中。向每個樣品中加入200 ng/mL IS肽段進行質譜分析。（2）方法B：酶切前處理方法。準確稱取蜂毒衍生品樣品1 g至10 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋溶解后，35℃氮吹至近干。加入1 mL去離子水渦旋復溶，于14 000 rpm4℃條件下離心12 min。收集上清液于新的2 mL離心管中。移取蛋白質溶液200μL與800μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100μL 30 mMDTT溶液，在室溫下反應60 min，然后再加入500μL 100 mMIAA溶液于室溫下暗反應60 min。樣品中加入30μL胰蛋白酶溶液，于37℃過夜酶切12 h。酶切反應完成后，加入1μL甲酸使胰蛋白酶失活，終止酶切反應，向每個樣品中加入200 ng/mL IS肽段。混合均勻后使用C18柱除鹽，將除鹽后的肽段干燥，用100μL初始流動相復溶進入液相色譜串聯質譜檢測。

（三）儀器方法

1.色譜條件。色譜柱為Thermo Hypersil GOLDTMC18（2.1 mm×100 mm，1.9μm）； 流動相組成：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫條件為：0～1.0 min，5%流動相B；1.0～2.0 min，5%～15%流動相B；2.0～12.0 min，15%～40%流動相B；12.0～14.0 min，40%～95%流動相B；14.0～16.5 min，95%流動相B；16.5～17.5 min，95%～5%流動相B；17.5～20.0 min，5%流動相B。流速為0.30 mL/min；進樣量為5.0μL；柱溫為40℃。

2.質譜條件。離子源參數：鞘氣的流速為38 arb；輔助氣的流速為15 arb；擋錐氣的流速為0 arb；電噴霧電壓3.2 kV；離子導管的溫度275℃；S-lens RF level設為60；離子源溫度380℃；采集的模式為正離子模式下的Full MS－ddMS2；其中Full MS的具體參數設置為：分辨率為70 000；AGC Target為3e6；最大離子注入時間為200 ms；質量掃描范圍為300～1 200 Da；數據類型為棒狀圖；dd-MS2的具體參數設置為：分辨率為17 500；AGC Target為1.6e5；最大離子注入時間為120 ms；Loop count為2；隔離窗口為2.0 Da；NCE為35；數據類型為棒狀圖；dd settings中，最小AGC為8.0e3；頂點觸發為2～6 s；同位素排除為on；動態排除為8.0 s。

表1 蜂毒肽特征肽段及同位素內標肽段的質譜分析參數

（四）方法學驗證

1.特異性。在蜂毒肽樣品中和空白樣品中提取篩選好的蜂毒肽特征肽段，觀察目標肽段的色譜峰的信噪比，明確空白樣本中是否存在干擾峰。

2.線性范圍。采用內標法定量，使用初始流動相分別配制特征肽段的同位素內標標準曲線，設置特征肽段濃度點分別為3、6、15、50、150、500 ng/mL，其中每個濃度點的標準溶液中都含50 ng/mL特征肽段對應的同位素內標肽段標品。準備好樣本由UHPLC－HRMS進行分析。

3.檢測限、定量限。不含蜂毒肽的空白樣品按照前處理方法操作后分析，將目標色譜峰的信噪比≥3時的濃度，設定為檢測限（LOD）；同時將信噪比≥10時的濃度設定為定量限（LOQ）。

4.準確度和精密度。本試驗選擇特征肽段低（LOQ）、中（2LOQ）、高（10LOQ）3個濃度水平進行回收率和精密度試驗。按前處理方法操作后分析，每個濃度重復6份，連續做3 d，計算日內精密度及日間精密度，得到的結果作為整個試驗方法的準確度和精密度。

二、結果與分析

（一）蜂毒肽特征肽段的篩選與確立特異性肽段的選擇是液相色譜串聯質譜定量靶向蛋白質方法開發的關鍵和難點，直接決定了后續建立方法的特異性、靈敏度和穩定性。選擇特征肽段時應遵循的基本原則是，肽段中氨基酸數目以8～20為宜，不應過短或者過長；且為質譜和液相友好型；選擇的肽段應具備特異性、穩定性和一定離子豐度的專屬性肽段，需通過蛋白質數據庫的比對；肽段中應當避免含有易于修飾的氨基酸，如天冬酰胺（N）、 谷氨酸（E）、 天冬氨酸（D）、 絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）、半胱氨酸（C）等；肽段中應避免含有胰蛋白酶漏切的位點（K或R）。通過與NCBI及UniProt數據庫比對，蜂毒肽水解之后的肽段VLTTGLPALISWIK具有唯一性，且在液相色譜串聯質譜上具有較好的相應值。蜂毒肽水解之后另外一條肽段GIGAVLK在搜庫匹配時，不具備唯一性，且在質譜中響應較低。因此，本研究將VLTTGLPALISWIK作為蜂毒肽的特征肽段開展液相色譜串聯質譜的定量分析方法開發。

（二）檢測方法的靈敏度、線性范圍、準確度與精密度

1.選擇性。樣本經提取、酶解、凈化、濃縮等前處理步驟之后，由UHPLC－HRMS進樣分析。蜂毒肽酶解之后的特征性肽段VLTTGLPALISWIK為儀器檢測的靶向物質，其精確質量數為m/z756.463 43（[M+2H]2+）， 其允許偏差應在5×10－6以內。該肽段的MS/MS圖譜（子離子圖譜）中含有豐度較高的碎片離子m/z927.564 09、585.359 38，兩者的精確質量數誤差應當＜10×10－6。用于定量的穩定同位素內標肽段VLTTGLPALISWIK*的m/z761.478 35（[M+2H]2+）， 其允許偏差也在5×10－6以內。其MS/MS圖譜（子離子圖譜）中應該含有蜂毒肽的肽段VLTTGLPALISWIK的特異性碎片離子m/z927.564 09、585.359 38；相應的，穩定同位素內標肽段的特征肽段VLTTGLPALISWIK*的子離子圖譜（MS/MS）中應含有碎片離子m/z935.604 06和m/z593.436 32，且其精確質量數的誤差應當＜10×10－6（見圖1）。蜂毒樣本中只有在精確m/z值和特征碎片離子方面同時滿足以上的特征，方可肯定所求的該蜂毒樣本中的VLTTGLPALISWIK含量可信，并可根據此含量的高低鑒別蜂毒質量；而且在該肽段的色譜峰附近無顯著干擾峰，在定量限時，具有較好的信噪比；此外，在空白樣本中，未觀察到對應的信號峰，表明本研究選擇的肽段具有較好的選擇性與特異性。

圖1 未經酶切時蜂毒肽色譜圖（A）；經酶切后蜂毒肽色譜圖（B）

圖2 未經酶切的蜂毒肽母離子質譜圖（A）；未經酶切的蜂毒肽二級質譜圖（B）；經酶切的蜂毒肽母離子質譜圖（C）；經酶切的蜂毒肽二級質譜圖（D）；未酶切時加入同位素內標質譜圖（E）；經酶切后加入同位素內標質譜圖（F）

2.線性關系。由試驗結果可知，蜂毒肽特征肽段在3～500 ng/mL的濃度范圍內，線性相關系數＞0.99，可見其在上述濃度范圍內線性關系良好。

3.檢測限、定量限。按照上文方法進行處理，結果顯示，檢測限為1μg/kg，定量限為3μg/kg。對蜂毒樣品未酶切和經酶切后均進行檢測，其檢測限（LOD）、定量限（LOQ）相差較大，樣品酶切后檢測限、定量限更低，檢測更為準確，方法學驗證結果見表2和表3。

表2 方法驗證相關系數

表3 未酶切與經酶切的蜂毒樣品檢測方法學驗證結果比較

4.準確性、精密度。本試驗選擇特征肽段高（10LOQ）、 中（2LOQ）、 低（LOQ）3個濃度水平進行回收率和精密度試驗，按上文方法前處理，進行加標回收率試驗。回收率和相對標準偏差結果見表2。結果顯示，在低、中、高3個濃度的添加回收率范圍為89.45%～113.23%，日內與日間變異系數均＜11.33%。

（三）開發的方法在實際樣本檢測中的應用采用本方法測定了大量樣品，包括面膜、膏藥、牙膏等市面標有“蜂毒”字樣的產品，從質譜數據中提取肽段的質荷比，計算m/z756.463 43處特征肽段和IS肽段峰面積的比值。實測樣本中蜂毒肽的檢出結果見表4。結果顯示，僅有26.92%的蜂毒肽衍生產品中可檢測出蜂毒肽。

三、討論

（一）儀器參數優化將特征肽段及其穩定同位素肽段的氨基酸序列輸入Xcalibur軟件中的Isotope simulation工具欄中，酶切得到的多肽在質譜正離子模式下通常形成帶雙電荷的離子的穩定形式，因此設置加合方式為[M+2H]2+，模擬特征肽段及其穩定同位素肽段的母離子和子離子質荷比。

表4 實測樣本中蜂毒肽含量

將特征肽段及其穩定同位素肽段溶解、稀釋為1μg/mL，在正離子模式下進行全掃（Full MS/dd MS2），調整碰撞能量和碰撞氣體（氮氣），對Inclusion list中包含的特征肽段進行碎裂，收集二級離子碎片信息。根據Full MS/dd MS2掃描結果，觀察施加給母離子的碰撞能的碰撞效果。在二級圖譜中若母離子信號強度過高則需適當增加碰撞能，反之則減小，一般選擇能量增加或減小5；其次觀察子離子碎片分布情況，若子離子碎片分布在較小的質荷比區域，則略微降低碰撞能，反之則增加，一般將能量以1～2增加或減小。直至母離子信號較弱、子離子質荷比又不至于過小且強度較高為止。

（二）蛋白提取方法比較不同蛋白提取方法會造成總蛋白測定結果不一，進而影響酶切效果和后期的定量結果。針對這個問題，本實驗參考了5種主要的蛋白質提取方法，對不同提取方法得到的蛋白溶液，使用Bradford法蛋白質定量試劑盒定量檢測蛋白濃度，結果如圖3所示。綜合蛋白提取濃度和試驗穩定性，選擇超濾管濃縮法提取蛋白。

圖3 5種蛋白提取方法比較

（三）方法比較當前常用的檢測方法主要是通過液相色譜串聯質譜的技術定量測定完整蜂毒肽，未經酶切，檢測其多電荷母離子及子離子進行定量。方法檢測限、定量限較高，定量限多為40 μg/kg，不適用于復雜基質中蜂毒肽含量的檢測。本方法經胰蛋白酶酶切后，可將長鏈多肽酶切為較短的短肽，靈敏度更高，更適用于質譜檢測。

使用超高效液相色譜串聯高分辨質譜（UHPLC－HRMS）對蜂毒樣本進行檢測，未酶切樣品與酶切樣品采用相同的液相色譜串聯質譜方法進行檢測，從結果中篩選蜂毒肽的特征肽段VLTTGLPALISWIK。對于蜂毒樣品的質譜數據進行提取，選擇特征肽段的母離子為m/z761.478 35（[M+2H]2+）的二級質譜圖，然后在二級質譜圖中提取子離子m/z935.604 06和m/z593.436 32。計算、比較胰蛋白酶酶切與未酶切蜂毒樣品中特征肽段/穩定同位素內標肽段峰面積比，其結果差異較大。

為提高試驗中定量結果的準確性，對比之前的外標法定量，本試驗選擇與特征肽段性質相似的穩定同位素肽段進行定量，確保定量結果更為準確、可重復性更高，對內源性多肽的質譜信號不斷增強，降低了對于給定目標蛋白的特征肽數量要求。

四、結論

本文建立超高效液相色譜串聯質譜法測定復雜基質中蜂毒肽含量的分析方法，并比較兩種前處理方式（胰蛋白酶酶切與未酶切蜂毒）下本方法的結果差異。結果表明，經胰蛋白酶酶切、使用同位素內標肽段后響應更高，檢測限、定量限更低，檢測結果更為穩定，可作為蜂毒肽衍生品中蜂毒肽含量測定的方法。