超高效液相色譜-串聯質譜法測定茭白中井岡霉素的殘留

張今君 林剛建 夏慧麗

（臺州市食品檢驗檢測中心，浙江臺州318000）

井岡霉素是吸水鏈霉菌井岡變種產生的一種水溶性抗生素，是1973年上海農藥研究所從江西井岡山地區土壤中分離得到的[1]。井岡霉素屬于七碳氨基環醇類抗生素，在生物活性上表現為廣譜的抗真菌活性，具有良好的防治植物病害的作用。經過40多年的農業應用，井岡霉素已經成為最成功的生物源殺菌劑之一，年產超過6萬t，產值超過4億元，可供近6 700萬hm2使用[2]，目前井岡霉素在我國登記作物有水稻、小麥、草坪。近年來由于氮素化肥使用增加等原因，紋枯病在全國各茭白種植地普遍發生，井岡霉素開始用于茭白中紋枯病的防治工作，且效果良好[3～4]。但目前井岡霉素在茭白中的使用評價工作還未推進[5]，有關茭白樣品中井岡霉素的檢測方法也未見報道，因此，本文建立茭白中井岡霉素殘留的檢測方法，以期為茭白中井岡霉素的使用評價提供技術支持。

井岡霉素的檢測方法有薄層層析法[6]、毛細管電泳法[7]、 氣相色譜法[8～9]、 液相色譜法[10～12]、 液相色譜－串聯質譜法[13～16]。薄層法用于定性分析，不能提供定量結果；毛細管電泳法檢出限為0.2 μg/mL，靈敏度較低；氣相色譜法測定井岡霉素需要衍生，過程繁瑣；液相色譜法中井岡霉素在210 nm處有最大吸收，多數物質在此波長下會有吸收，易引起基質干擾，定性能力較差。超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC－MS/MS）將質譜的高選擇性、高靈敏度與液相的高效分離能力相結合，近年來在農藥檢測中被廣泛應用，本文應用固相萃取方法凈化，親水作用色譜（HILIC）分離，結合UPLC－MS/MS技術建立茭白中井岡霉素殘留量的檢測方法。

一、材料與方法

（一）材料與儀器

1.樣品采集。茭白來自于市售。

2.標準品與試劑。井岡霉素（純度86.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，德國Merck）；去離子水，Milli－Q系統純凈水；Oasis HLB小柱，6 mL/200 mg，美國Waters公司。

3.儀器設備。QTRAP 5500三重四極桿－線性離子肼質譜系統，美國AB Sciex公司；UPLC液相色譜系統，日本島津公司；Allegra X－30R冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；渦旋混勻器，德國IKA；2150 TH超聲波儀，上海安譜；PR 1602ZH/Z電子天平，奧豪斯電子天平有限公司。

（二）標準曲線繪制

1.標準儲備液的配制。準確稱取井岡霉素標準品10 mg（精確至0.01 mg），用水溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL標準儲備液， －18℃避光保存。

2.標準工作溶液的配制。準確吸取上述標準儲備液0.1 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，配制成濃度為10μg/mL的標準中間液，于4℃避光保存。使用時用水配制成合適濃度標準工作溶液，現配現用。

3.標準工作曲線。按優化條件將稀釋成合適濃度的標準工作液上機測試，以化合物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。

（三）儀器條件

1.色譜條件。Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）色譜柱，柱溫為35℃，流速為300μL/min，進樣體積為5 μL，流動相A為含0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈。洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

2.質譜條件。電噴霧離子源（ESI源），正離子掃描（ESI+）；多反應監測（MRM）；電噴霧電壓（IS）5 500 V；霧化氣壓力（GS1）50 psi； 輔助氣壓力（GS2）50 psi； 氣簾氣壓力（CUR）35 psi； 離子源溫度（TEM）500℃。化合物定量離子對498.2/178.2，定性離子對498.2/336.2，滯留時間100 ms，去簇電壓（DP）100V，定量離子對碰撞能量（CE）36 eV，定量離子對碰撞能量（CE）32 eV。

（三）凈化方式選擇稱取2.00 g（精確至0.01 g）粉碎均勻的空白樣品18份，分成3組，每組6份，置于50 mL離心管中，分別添加2.5、10.0、50.0、100.0、200.0μg/L井岡霉素標準溶液各1 mL，加入9 mL甲醇，振蕩離心后，移取上清液，上清液在45℃水浴中氮吹濃縮至2.5 mL以下待凈化。實驗以空白樣品為對照，比較固相萃取、液液萃取、分散固相萃取3種凈化方式對茭白中井岡霉素回收率的影響，重復測定3次。

1.固相萃取法：提取液轉入經過預先處理的Oasis HLB小柱，用2 mL水淋洗柱子，收集全部流出液和淋洗液，加水定容至5.0 mL，混勻，過0.22μm濾膜，上機測試。

2.液液萃取法：提取液加水定容至5.0 mL，加入5 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，棄去乙酸乙酯層，重復操作1次，過0.22μm濾膜，上機測試。

3.分散固相萃取法：提取液加水定容至5.0 mL，加入100mg PSA、100 mg C18，渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，過0.22μm濾膜，上機測試。

（五）實測樣品前處理

1.提取：稱取2.00 g（精確至0.01g）粉碎均勻的樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL甲醇，劇烈振蕩10 min，在4℃下6 000 r/min離心5 min，將上清液傾入15 mL離心管中，在45℃水浴中氮吹濃縮至2.5 mL以下待凈化。

2.凈化：將上述提取液轉入經過預先處理的Oasis HLB小柱，用2 mL水淋洗柱子，收集全部流出液和淋洗液，加水定容至5.0 mL，混勻，過0.22μm濾膜，上機測試。

（六）基質效應將標準儲備液分別用水和基質溶液稀釋成0.5、2.0、10.0、20.0、50.0μg/L的標準工作液，上機測試，按照濃度和對應峰面積繪制線性方程。基質效應按公式（1）計算。

公式（1）中，ME表示基質效應的大小，當ME為正時為基質增強，當ME為負時為基質抑制；Sm為基質匹配標準溶液斜率，Ss為溶劑標準溶液斜率[17]。

二、結果與分析

（一）色譜條件的選擇實驗比較了BEH C18和BEH HILIC兩種色譜柱對井岡霉素的保留能力和分離效果。用BEH C18分離時，井岡霉素在0.83 min出峰，響應強度為3 900 cps，保留能力差，響應較低；用BEH HILIC分離時，化合物保留能力及響應強度增強，出峰時間為3.25 min，響應強度為6 040 cps。因為井岡霉素是極性化合物，HILIC色譜柱配合高比例有機相流動相可有效改善極性化合物保留行為，同時提高電噴霧離子化效率，靈敏度上升。實驗又比較了a組乙腈∶0.1%甲酸水；b組0.1%甲酸乙腈∶0.1%甲酸水；c組0.1%甲酸乙腈∶0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸銨水3組流動相對色譜峰的影響，結果顯示，a組流動相中，色譜峰形拖尾，響應較低；c組流動相中色譜峰形對稱，但響應強度只有1 400 cps；b組流動相色譜峰形對稱且響應強度高。因此本文選用BEH HILIC色譜柱配合0.1%甲酸乙腈∶0.1%甲酸水對茭白樣品中井岡霉素進行分離。25μg/kg井岡霉素在兩種色譜柱及3組流動相中的色譜圖見圖1。

圖1 25μg/kg井岡霉素在兩種色譜柱及3組流動相中的色譜圖

（二）凈化條件的選擇實驗比較了固相萃取、液液萃取、分散固相萃取3種凈化方式對茭白中井岡霉素回收率的影響，實驗結果如圖2所示，可以看出，固相萃取法中5個添加水平井岡霉素的回收率均較高，不同濃度水平間重復性較好，平均回收率為102.9%，標準差（SD）為4.5%；液液萃取法回收率比固相萃取法低，5個濃度水平平均回收率為88.4%，標準差（SD）為9.6%；分散固相萃取法平均回收率為45.5%，標準差（SD）為11.5%。3種凈化方式中分散固相萃取法回收率最低，液液萃取法有機溶劑使用量較大，相比而言，固相萃取法溶劑使用量較少，且采用Oasis HLB色譜柱可有效去除茭白中蛋白、糖類等基質干擾，減少基質效應。因此本文采用固相萃取法對樣品進行凈化。

圖2 3種凈化方式對回收率的影響

（三）線性方程及基質效應按上述實驗方法配制0.5～50.0μg/L濃度范圍的溶劑標準溶液和基質匹配標準溶液，以定量離子峰面積對應相應濃度繪制標準曲線，獲得各自線性方程，計算基質效應，結果見表2。結果顯示，井岡霉素在0.5～50.0μg/L濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 9。基質效應為0.3%，基質增強效應小，選擇純水配制標準工作溶液。

（四）方法的靈敏度、準確度和精密度利用茭白空白基質進行定量限的考察，以10倍信噪比確定井岡霉素定量限；在茭白空白基質中分別按5.0、10.0、50.0μg/kg 3個濃度水平進行加標回收實驗，重復測定6次。結果表明，在5.0～50.0μg/kg濃度范圍內，井岡霉素在茭白中的平均回收率為98.5%～107.4%，相對標準偏差為2.2%～2.8%，方法定量限為5.0μg/kg。方法精密度和回收率均滿足GB/T 27404－2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》標準[18]要求。具體數據見表3。

表2 不同溶劑中線性方程及基質效應

（五）實際樣品測定應用建立的方法對茭白樣品中的井岡霉素殘留量進行測定，40批次樣品中檢出井岡霉素3批次，檢測結果分別為9.2、10.5和8.8μg/kg。

表3 井岡霉素的回收率、標準偏差及檢出限等（n＝6）

三、結論

本文選用Oasis HLB小柱固相萃取凈化，BEH HILIC色譜柱分離，結合超高效液相色譜－串聯質譜技術，建立了茭白中井岡霉素殘留量的檢測方法。結果表明，井岡霉素在0.5～50.0μg/L濃度范圍內的線性關系良好，相關系數為0.999 9，3個添加水平的回收率范圍為98.5%～107.4%，相對標準偏差為2.2%～2.8%，定量限為5.0μg/kg，滿足相關標準規范要求。本方法靈敏度高，選擇性好，適用于茭白樣品中井岡霉素的定性和定量檢測。