動物源性食品中氨苯砜及其代謝物殘留的分析方法研究進展

伍 姿 黃冬梅 婁曉祎 孔 聰 張 璇 方長玲 葉洪麗

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，上海200090；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

動物源性食品是指全部可食用的動物組織以及蛋和奶，包括肉類及其制品（含動物臟器）、水生動物產(chǎn)品等。隨著我國居民生活水平的日益提高，動物源性食品已成為國民飲食結(jié)構(gòu)的主要成分[1]。但動物源性食品目前存在著一些安全隱患，主要包括藥物殘留（獸藥殘留和農(nóng)藥殘留）、重金屬超標、劣質(zhì)動物疫苗以及環(huán)境污染等。近年來，為了防治各種動物疫病、縮短動物飼養(yǎng)周期、降低動物死亡率，從而提高動物源性食品的產(chǎn)量，存在不合理甚至非法使用藥物，導(dǎo)致動物源性食品中藥物殘留超標的問題[2]。尤其是獸藥，在水產(chǎn)和畜牧業(yè)中的使用較多，這些藥物可經(jīng)食物鏈傳遞危及人類健康，因此動物源性食品中獸藥殘留問題備受關(guān)注[3]。

氨苯砜（4，4"－diaminodiphenylsulfone，DDS）作為一種禁用的獸藥，使用后不能完全代謝分解，可能殘留于動物體內(nèi)，從而導(dǎo)致動物源性食品中存在一定的氨苯砜及其代謝物殘留。然而現(xiàn)階段對氨苯砜及其代謝物殘留量檢測的研究和報道并不多，因此必須加強對動物源性食品中氨苯砜及其代謝物殘留的檢測和監(jiān)控。本文概述了氨苯砜及其代謝產(chǎn)物的作用機制、危害和法規(guī)標準，系統(tǒng)地綜述了動物源性食品中氨苯砜及其主要代謝產(chǎn)物N－乙酰氨苯砜的前處理方法和檢測方法，同時對其分析方法進行了展望，旨在為動物源性食品中氨苯砜及其代謝物殘留量的檢測和監(jiān)控提供參考。

一、氨苯砜及其代謝產(chǎn)物的作用機制

氨苯砜是一種苯胺衍生物，在1908年首次合成，屬于合成砜類，呈黃白色無臭結(jié)晶性粉末，分子式為C12H12N2O2S，包含一個硫原子連接兩個碳原子的結(jié)構(gòu)。DDS性質(zhì)穩(wěn)定，可燃，和強氧化劑不相溶，代謝產(chǎn)物為N－乙酰氨苯砜（N－acetyl dapsone，MADDS）和羥胺氨苯砜（DDS－NOH）。口服給藥后，DDS幾乎完全被腸道吸收，生物利用率超過86%[4]。DDS由腸道吸收后經(jīng)過肝腸循環(huán)由肝臟代謝，也由活化的多形核白細胞（PMN）和單核細胞代謝。在肝臟中，氨苯砜主要通過N－乙酰基轉(zhuǎn)移酶的乙酰化作用，代謝為N－乙酰氨苯砜，并通過細胞色素p－450羥化酶的羥基化作用，產(chǎn)生羥胺氨苯砜[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，氨苯砜具有一定的藥物經(jīng)濟效益，與磺胺類藥物具有協(xié)同增效作用，常作為磺胺增效劑在動物和水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。DDS及其代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有磺酰基，是發(fā)揮藥效的主要基團，DDS及其代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗炎的作用[6～7]。其抗菌作用主要是通過與對氨基苯甲酸（PABA）競爭二氫喋啶合成酶活性位點，從而抑制細菌中的二氫葉酸合成酶（DHPS），干擾葉酸合成，進而影響細菌的生長繁殖[6]；抗炎作用主要是通過影響中性粒細胞或嗜酸性粒細胞，使其在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生具有清除作用的氧自由基等物質(zhì)，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而作為抗炎藥用于治療以中性粒細胞或嗜酸性粒細胞積聚和活化為特征的慢性炎癥性皮膚病，減少對機體的損傷[7～8]。

二、氨苯砜及其代謝產(chǎn)物殘留的危害及法規(guī)標準

（一）氨苯砜及其代謝產(chǎn)物殘留的危害在動物養(yǎng)殖過程中，氨苯砜及其代謝產(chǎn)物可以抑制多種致病菌的生長，如麻風(fēng)桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎球菌等，對于某些皮膚病和傳染病有著明顯的治療作用，但氨苯砜會經(jīng)過食物鏈富集傳遞危及人類健康[7，9]。研究表明，氨苯砜藥物經(jīng)機體吸收后廣泛分布于體內(nèi)，與其代謝產(chǎn)物能夠保留在皮膚和肌肉，尤其是肝臟和腎臟中[9]。該藥物還能分散到汗液、唾液、眼淚和膽汁中，甚至可以穿過血腦屏障和胎盤，進入母乳。50%～90%的DDS可與血漿蛋白結(jié)合，而MADDS幾乎完全與血漿蛋白結(jié)合，存在明顯的毒副作用[5]。最顯著的副作用是與劑量相關(guān)的溶血（可能導(dǎo)致溶血性貧血）和高鐵血紅蛋白血癥，甚至造成罕見的再生障礙性貧血，還可能對肝腎功能和神經(jīng)系統(tǒng)造成損害[4,10]。

（二）國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)及標準關(guān)于動物源性食品中氨苯砜及其主要代謝產(chǎn)物N－乙酰氨苯砜殘留的問題已引起了國際組織以及許多國家和地區(qū)的高度重視。根據(jù)歐洲委員會指令，DDS已被禁止用于生產(chǎn)食品的動物，歐盟2377／90、37／2010公告也明確規(guī)定DDS是禁用獸藥。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告發(fā)布的 《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》中規(guī)定DDS禁止使用于所有的食品動物[11]；GB/T 29706－2013《食品安全國家標準動物性食品中氨苯砜殘留量的測定 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定，動物性食品中DDS殘留量的檢出限為0.1μg/kg，定量限為0.5μg/kg[12]；出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 2219－2008《進出口動物源性食品中氨苯砜及其代謝產(chǎn)物殘留量檢測方法液相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜法》規(guī)定，進出口動物源性食品中DDS及其代謝產(chǎn)物殘留量的檢出限為0.5 μg/kg[13]；國家標準GB/T 22940－2008《蜂蜜中氨苯砜殘留量的測定 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定蜂蜜中DDS殘留量的檢出限為2.0μg/kg[14]。

三、氨苯砜及其代謝產(chǎn)物的樣品前處理方法

對于氨苯砜及其主要代謝產(chǎn)物N－乙酰氨苯砜殘留的檢測，其樣品前處理過程主要有提取、凈化、濃縮等步驟，常用的提取試劑、凈化材料和濃縮方法見表1。其中凈化過程復(fù)雜，方法靈活多樣，所以這一步驟非常關(guān)鍵，也是研究的重點，需要根據(jù)不同樣品基質(zhì)和檢測要求選擇正確的凈化方法。目前在動物源性食品中，有關(guān)提取氨苯砜及其代謝產(chǎn)物N－乙酰氨苯砜最常用的樣品前處理凈化方法包括液－液萃取法（liquid－liquid extraction，LLE）、 固相萃取法（solid phase extraction，SPE）、分子印跡技術(shù)（molecular imprinting，MI）等。

表1 氨苯砜樣品前處理提取試劑、凈化材料和濃縮方法

（一）液－液萃取法液－液萃取法作為一種經(jīng)典的凈化方法，通常采用漏斗振蕩或渦旋萃取兩種方式，利用待測組分在不相混溶的兩種溶劑中溶解性的差異從而達到凈化的目的。對于氨苯砜殘留的檢測常使用甲醇和乙腈等有機溶劑進行萃取，該法可一次用于多個樣品的萃取，從而將被測組分從大量內(nèi)源性物質(zhì)中分離出來，并減少雜質(zhì)對測定的干擾。彭濤等[15]在聚丙烯離心管中用酸化乙腈萃取雞肉組織中的氨苯砜，然后渦旋、振蕩、離心后收集上清液，操作簡單、經(jīng)濟實用；岑海蓉等[16]用體積比為80%的乙腈水溶液提取豬肉樣品組織中的氨苯砜和N－乙酰氨苯砜，再經(jīng)渦旋、超聲等液液萃取法進行處理，最后可將萃取液蒸發(fā)，使組分富集。液－液萃取法雖然對實驗條件和儀器要求不高，但該方法的凈化效果相對較差、操作費時、有機溶劑消耗大。

（二）固相萃取法固相萃取法是基于色譜分離最常用的樣品前處理凈化方法，將待測物質(zhì)從不同樣品中分離后，經(jīng)過不同類型的固相萃取柱，利用選擇性吸附和選擇性洗脫的分離原理進行樣品凈化。該法既可用于復(fù)雜樣品中微量或痕量目標化合物的提取，又可用于凈化、濃縮和富集。目前，已有多種SPE柱被用于氨苯砜樣品的凈化，如C18柱、HLB柱、MCX柱等，對于分離純化動物源性食品中的氨苯砜及其代謝產(chǎn)物均有一定效果。田云等[17]在檢測動物組織樣品中的氨苯砜及N－乙酰氨苯砜殘留的過程中，用HLB和MCX固相萃取柱依次凈化，濃縮后檢測得到定量下限為0.5μg/kg，回收率為92%～103%，結(jié)果能夠達到國際標準；岑海蓉等[16]采用新型Oasis PRiME HLB固相萃取柱進行凈化，處理過程簡單、省時且回收率高；孫曉娟等[18]用HLB固相萃取柱萃取凈化，經(jīng)40%的甲醇溶液淋洗，檢測得到的結(jié)果回收率高，為90.0%～110.0%，檢出限為0.1μg/kg。

（三）分子印跡技術(shù)分子印跡技術(shù)（molecularly imprinted technique，MIT）是一種高選擇、高專一性的分離技術(shù)。分子印跡聚合物（MIP）是一種新型的分子識別材料，這種材料具有高度的專一性和穩(wěn)定性，其識別機制與抗體－抗原反應(yīng)類似，能夠用于物質(zhì)的特異性吸附[19]。MIP制備簡單，能反復(fù)使用，機械強度高，穩(wěn)定性好，適用于作為SPE的填充劑或分子印跡薄膜，從而分離富集復(fù)雜基質(zhì)中的痕量分析物，已被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留的分析。盧福廣等[20]通過制備氨苯砜分子印跡化學(xué)發(fā)光傳感器檢測動物源性食品和藥物中氨苯砜的含量，該法不僅節(jié)省溶劑，還能夠很好地減少復(fù)雜基質(zhì)和雜質(zhì)的干擾，分析也更簡便，比傳統(tǒng)固相萃取法具有更好的凈化效果。

四、氨苯砜及其代謝物殘留量的檢測方法

由于獸藥殘留種類及代謝產(chǎn)物多樣，其分析要求檢測方法應(yīng)具有靈敏度高、線性范圍寬、特異性強、高通量等特點。目前，國內(nèi)外關(guān)于動物源性食品中氨苯砜及其代謝物殘留量的檢測均有相應(yīng)的研究和報道，DDS殘留檢測方法的建立始于20世紀70年代，隨著新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，DDS及其代謝產(chǎn)物的檢測方法可大致分為3類，即儀器分析法、免疫分析法和化學(xué)發(fā)光分析法。各種檢測方法及檢測結(jié)果見表2。

（一）儀器分析法該類方法主要是指基于色譜和質(zhì)譜分析技術(shù)發(fā)展起來的定性定量檢測技術(shù)。色譜分析技術(shù)包括氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）。作為分離分析各種復(fù)雜混合物的重要方法，色譜分析技術(shù)分離效率高、速度快、可進行大規(guī)模的純物質(zhì)制備。質(zhì)譜分析技術(shù)（MS）不僅具有獨特的選擇性和靈敏度，還有精確的相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息分析能力。色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、強大的定性能力相結(jié)合，成為目前獸藥殘留分析領(lǐng)域中最強大的分析手段，最有力的定性定量工具，主要包括氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）和液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS）。其中，HPLC和LC－MS可用于氨苯砜及其代謝產(chǎn)物N－乙酰氨苯砜殘留量的檢測。

1.高效液相色譜法。HPLC采用一定的提取手段將被分析對象溶于可作為流動相的溶劑中，直接進行檢測分析，具有柱效高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點，可作為動物源性食品中氨苯砜及其代謝物殘留量的檢測方法。2000年，霍燕蘭等[26]采用HPLC法對氨苯砜進行定量分析，可有效地將主成分和雜質(zhì)分離，重現(xiàn)性好，結(jié)果準確度高；2003年，陳亮等[27]建立HPLC法測定固體分散體中氨苯砜含量，分離效果好，方法回收率高，可用于氨苯砜－固體分散體的質(zhì)量控制；2008年，韓現(xiàn)芹等[21]建立反相高效液相色譜法（RP－HPLC）測定牙鲆血漿中氨苯砜的濃度，該法操作簡單，分離速度快，結(jié)果線性關(guān)系良好，最低檢出限為0.01μg/mL；2013年，何丹等[28]建立RP－HPLC法測定氨苯砜的含量，結(jié)果準確，回收率高，可用來檢測氨苯砜制劑的含量。國外研究中，HELA等[29]建立了用二極管陣列高效液相色譜法（HPLC－DAD）測定肌肉、肝臟和腎臟中氨苯砜含量，該方法在294 nm處檢測苯砜類藥物，檢出限為1 ng/kg。

表2 氨苯砜及其代謝物殘留的檢測方法、回收率、檢出限及相對標準偏差

2.液相色譜－質(zhì)譜法。液相色譜－質(zhì)譜法是一種檢測復(fù)雜有機化合物的有效手段，被廣泛應(yīng)用于檢測魚肉、肌肉、內(nèi)臟、雞蛋和牛奶等動物源性食品中的氨苯砜及其代謝產(chǎn)物殘留。謝潔等[22]建立了奶粉中氨苯砜殘留檢測的HPLC－MS/MS定量確證方法。該方法的檢出限為0.05μg/kg，定量限為0.04 ng/kg，在0.04～0.4 ng/kg的添加范圍內(nèi)，回收率為88.5%～91.4%，變異系數(shù)＜7.7%。彭濤等[15]建立了HPLC－MS/MS定量確證方法，檢測雞肉組織中氨苯砜，檢出限為0.015μg/kg，在0.05～5 μg/kg的添加范圍內(nèi)，回收率為76.2%～94.5%，變異系數(shù)小于19.4%。田云等[17]建立了液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC－ESI MS/MS）檢測方法，檢測動物組織中氨苯砜及其代謝產(chǎn)物N－乙酰氨苯砜，定量下限為0.5μg/kg，線性范圍為0.5～5.0μg/kg，加標回收率為92%～103%，相對標準偏差為4.8%～11.0%。岑海蓉等[16]建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS）對牛肉、豬肉中的氨苯砜和N－乙酰氨苯砜進行檢測，在實驗濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均＞0.99，回收率為80%～113%，變異系數(shù)＜10%，定量下限達1.0 μg/kg。此外，國內(nèi)相關(guān)標準GB/T 29706－2013、SN/T 2219－2008和GB/T 22940－2008均采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動物源性食品中氨苯砜及其代謝物殘留量。在國外，RHIJN等[30]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對牛奶中殘留的磺胺類化合物進行定量分析，其中對于氨苯砜殘留的檢出限為5μg/kg；HADJIGEORGIOU等[10]建立了HPLC－MS法用于測定豬肉和牛奶中的氨苯砜含量，檢出限為5μg/kg。

（二）免疫分析法免疫分析法是以抗體作為分析試劑，對待檢測物進行定量或定性分析的檢測方法，也適用于動物源性食品中獸藥殘留的檢測[31～32]。目前，關(guān)于免疫分析應(yīng)用于氨苯砜殘留檢測的方法有酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析法。

1.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。酶聯(lián)免疫吸附法是以固相載體吸附抗原/抗體為基礎(chǔ)，利用標記酶化學(xué)放大的靈敏性和抗體的特異選擇性而建立起來的，從而利用標記物的酶催化底物的顯色反應(yīng)來反映抗原抗體結(jié)合的過程[33]。ELISA法前處理簡化、特異性和靈敏度高、檢測快速準確，具有廣泛的實際應(yīng)用價值，也適用于動物源性食品中氨苯砜及其代謝產(chǎn)物殘留量的大批量、快速檢測[34]。鄭小嬌等[23]建立直接競爭ELISA法，快速檢測動物性食品中氨苯砜殘留。結(jié)果顯示，該方法的最低檢出限達0.03 ng/mL，加標回收率為75.45%～91.75%。通過試驗還表明，該檢測方法對牛奶、蜂蜜、豬肉和雞蛋的最低檢出限分別可達到0.05、0.07、0.06和0.07 ng／mL；陶光燦等[24]建立了間接競爭ELISA法快速檢測動物源性食品中氨苯砜殘留量的方法。該方法對雞肉和豬肉的檢出限是0.2μg／kg，對雞蛋和蜂蜜的檢測限為2μg/kg，對牛奶的檢測限為0.6μg／L，樣品回收率可達78.2%～104.0%。

2.膠體金免疫層析法（CGIC）。膠體金免疫層析法是以膠體金標記技術(shù)為基礎(chǔ)，使用金納米顆粒標記抗體作為示蹤物，結(jié)合抗原抗體的免疫反應(yīng)檢測樣本中的痕量待測物。該方法可初步實現(xiàn)定量檢測，操作簡單，檢測速度快，靈敏度較高，成本較低，適合現(xiàn)場和高通量快速檢測[35]。趙興然等[25]建立了GICA法，快速檢測動物源性食品中氨苯砜殘留含量，最低檢出限為20μg/L。該方法操作簡便、快速，適用于大批量臨場動物源性食品中DDS殘留的快速定性檢測。

（三）化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光分析法是指根據(jù)某一時刻化學(xué)發(fā)光強度或化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的總發(fā)光強度來測定物質(zhì)含量的分析方法。該法儀器設(shè)備簡單，靈敏度高，線性范圍寬，分析速度快，但選擇性比較差。關(guān)于應(yīng)用化學(xué)發(fā)光分析法檢測氨苯砜是將分子印跡技術(shù)應(yīng)用到化學(xué)發(fā)光分析中，利用分子印跡聚合物的高選擇性，從而提高化學(xué)發(fā)光分析的選擇性。這兩種方法結(jié)合是一種新型高選擇性的在線測定新方法。在目前的研究進展當中，盧福廣[20]建立了分子印跡－化學(xué)發(fā)光分析法（MI－CLA），用于檢測動物源性食品和藥物中氨苯砜的含量。通過制備氨苯砜分子印跡化學(xué)發(fā)光傳感器，測定氨苯砜的工作曲線為 ΔI＝191.8+4.097×107c（mol/L）（R2＝0.998 3）， 該方法的線性范圍為1.0×10－6～1.0×10－4mol/L， 檢出限為5.3×10－7mol/L， 回收率為95%～103%。

五、結(jié)語

氨苯砜作為一種具有抗菌、抗炎作用的獸藥，大劑量使用時顯示殺菌作用，但其毒性較大，易經(jīng)食物鏈傳遞危及人類健康。目前國內(nèi)關(guān)于快速檢測氨苯砜及其代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究尚不完善，有待于進一步開發(fā)探索。對于氨苯砜及其代謝產(chǎn)物N－乙酰氨苯砜殘留檢測的前處理方法常用乙腈萃取，正己烷去脂，HLB和MCX固相萃取法凈化，而分子印跡技術(shù)作為新興前處理技術(shù)，以其較好的凈化特點極具“發(fā)展?jié)摿Α薄Ｄ壳皩τ跈z測方法的研究主要是基于液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，該法靈敏度高，回收率好，能檢測痕量水平的殘留，但儀器設(shè)備昂貴；免疫分析法能夠縮短分析時間，降低成本，但抗原抗體的制備較為復(fù)雜，應(yīng)用具有一定的局限性；化學(xué)發(fā)光分析法作為一種新型檢測方法發(fā)展前景雖好，但檢測器和發(fā)光材料的制備較為復(fù)雜。因此，探究針對不同基質(zhì)的動物源性食品，對樣品的前處理方法和檢測方法進行改進和優(yōu)化，建立簡便、靈敏和自動化程度高的樣品前處理分析檢測聯(lián)用技術(shù)，將具有廣泛的發(fā)展空間和應(yīng)用潛力，對于動物源性食品中氨苯砜及其代謝物殘留量的檢測和監(jiān)控具有重大意義。