王彥云 楊曙明
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100081)
肉產(chǎn)品味道鮮美,是最富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的動(dòng)物性食品之一。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和消費(fèi)結(jié)構(gòu)的改變,肉產(chǎn)品在餐桌上占的比重不斷增加。但是由于政府監(jiān)管不足、企業(yè)責(zé)任意識(shí)欠缺、消費(fèi)者安全意識(shí)薄弱,一些肉產(chǎn)品安全事件給國(guó)內(nèi)行業(yè)發(fā)展、消費(fèi)者信心、政府公信力、國(guó)際形象等方面造成較大沖擊。針對(duì)肉產(chǎn)品的加工、生產(chǎn)、銷(xiāo)售全過(guò)程建立追溯管理體系,是控制肉產(chǎn)品質(zhì)量安全最常用的方法[1]。追溯體系的建立,有助于從源頭有效控制污染的傳播范圍,將對(duì)社會(huì)的影響降到最低[1]。對(duì)動(dòng)物個(gè)體及產(chǎn)品的追溯管理,是保證食品質(zhì)量安全、保護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益的重要手段[2]。
SNP(single ncleotide polymorphism), 又名單核苷酸多態(tài)性,是基因組水平上單個(gè)堿基的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性,屬于第三代遺傳標(biāo)記技術(shù)。本文對(duì)現(xiàn)有SNP標(biāo)記在肉產(chǎn)品溯源以及肉類(lèi)品種溯源方面的研究進(jìn)行了歸納,有利于今后SNP標(biāo)記技術(shù)在肉產(chǎn)品溯源領(lǐng)域更為廣泛的應(yīng)用。
分子標(biāo)記(molecular markers)在溯源中是一個(gè)非常重要的概念,是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映,早在20世紀(jì)末就已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的育種研究、性狀與基因的研究。分子標(biāo)記自誕生之日起不斷發(fā)展,逐漸應(yīng)用于肉產(chǎn)品的溯源研究與應(yīng)用中。動(dòng)物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育,往往會(huì)使得其外部形態(tài)發(fā)生極大的變化;同時(shí),肉產(chǎn)品在加工處理后,也會(huì)加大溯源難度。然而,基于分子標(biāo)記技術(shù)的溯源方法不受產(chǎn)品形態(tài)的影響,可以逆行對(duì)品種個(gè)體做到準(zhǔn)確鑒定[3~4]。20世紀(jì)90年代,單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)首次見(jiàn)于人類(lèi)分子遺傳雜志,成為繼擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified restriction fragment polymorphism,AFLP)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性(simple sequence repeat,SSR)之后的第3代遺傳標(biāo)記技術(shù)。由于具有存在廣泛、遺傳穩(wěn)定性高、富有代表性以及易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化等特點(diǎn),SNP溯源技術(shù)廣泛應(yīng)用于溯源研究[5~7],已實(shí)現(xiàn)在豬肉、羊肉和牛肉等畜禽個(gè)體及產(chǎn)品溯源中的成功應(yīng)用。
(一)數(shù)量多且分布廣SNP在基因組中存在廣泛,可位于基因編碼區(qū)、基因的非編碼區(qū)以及基因間區(qū)(基因和基因之間)。就人類(lèi)基因組而言,SNP的總量超過(guò)300萬(wàn)個(gè)。在哺乳動(dòng)物中,平均每500~1 000個(gè)堿基,就有一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),利用基因上以及基因與基因之間廣泛存在的SNP位點(diǎn),可以建立一系列的標(biāo)記,通過(guò)變異位點(diǎn)、變異序列與性狀關(guān)系的研究,可以對(duì)個(gè)體和群體間基因上的差異有更深的了解[8~9]。
(二)遺傳穩(wěn)定性高SNP的形成是歷史進(jìn)化的結(jié)果,通常來(lái)說(shuō),先形成的SNP比之后形成的SNP在種群中所占的比率要高。相比于其他分子標(biāo)記,SNP標(biāo)記為單核苷酸的突變,且突變頻率很低,與一些不良性狀也不存在連鎖遺傳,因此屬于可遺傳的變異,遺傳穩(wěn)定性高[10~12]。
(三)富有代表性已有研究表明,位于基因內(nèi)部的某些SNP可能直接影響動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)的合成與表達(dá),通常直接表現(xiàn)為個(gè)體差異和種群差異。SNP所含有的這種特性使其在復(fù)雜性狀研究以及在動(dòng)物個(gè)體鑒定、種間鑒定和產(chǎn)地溯源方面有天然的優(yōu)勢(shì)[2]。
(四)易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化自然界中的大部分生物是二倍體。在二倍體生物中,SNP等位基因只有一對(duì),也叫作雙等位基因。基于SNP的這種遺傳二態(tài)性,一個(gè)SNP理論上可以區(qū)分3種基因型,從而可以對(duì)3個(gè)動(dòng)物個(gè)體作出鑒定。傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記方法,例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、微衛(wèi)星,需要對(duì)片段的長(zhǎng)度作出測(cè)量,過(guò)程繁瑣、工作量大,而SNP檢測(cè)結(jié)果的分析只需要判斷結(jié)果只是顯示為需要+/-即可。SNP的二態(tài)性也有利于進(jìn)行基因分型和自動(dòng)化篩選,這使得基于SNP的檢測(cè)分析方法易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化[13~17]。
要實(shí)現(xiàn)DNA分子標(biāo)記技術(shù)在肉產(chǎn)品溯源實(shí)踐中的應(yīng)用,需要開(kāi)發(fā)滿(mǎn)足要求的SNP。一般來(lái)說(shuō),SNP的開(kāi)發(fā)方法有兩種,一是根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)等數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)中已報(bào)道的SNP位點(diǎn),通過(guò)群體驗(yàn)證選擇標(biāo)記位點(diǎn);二是基于性狀基因新位點(diǎn)的開(kāi)發(fā),選擇當(dāng)前文獻(xiàn)中已報(bào)道的與肉質(zhì)及體態(tài)性狀相關(guān)基因擴(kuò)增,并對(duì)多樣本測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì),得到新的SNP位點(diǎn)。
(一)基于數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)的位點(diǎn)開(kāi)發(fā)基于數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)的位點(diǎn)開(kāi)發(fā)是SNP開(kāi)發(fā)的最主要的途徑,主要包括3方面內(nèi)容:(1)位點(diǎn)的挑選。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,結(jié)合參考文獻(xiàn),依據(jù)一定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行位點(diǎn)的挑選。(2)位點(diǎn)同源性分析。由于一部分位點(diǎn)存在多高同源,即位點(diǎn)所在的基因區(qū)段與基因組內(nèi)其他區(qū)段同源性很高。這些位點(diǎn)做PCR檢測(cè)的時(shí)候也都會(huì)被擴(kuò)增出來(lái),影響結(jié)果的判讀,不適合做高通量測(cè)序,因此需要對(duì)挑選的位點(diǎn)進(jìn)行同源性分析,舍去高同源性位點(diǎn)。(3)位點(diǎn)的驗(yàn)證。篩選后的位點(diǎn),經(jīng)多重PCR擴(kuò)增模板,產(chǎn)物純化后上高通量基因分型平臺(tái)進(jìn)行測(cè)定,將沒(méi)有測(cè)出的位點(diǎn)剔除,剩下各位點(diǎn)在測(cè)試群體中的等位基因頻率、基因型頻率通過(guò)直接計(jì)數(shù)方式獲得[18]。
(二)基于性狀基因的位點(diǎn)開(kāi)發(fā)基于性狀基因的位點(diǎn)開(kāi)發(fā),是通過(guò)對(duì)多樣本目的基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì),從而發(fā)掘新的多態(tài)性位點(diǎn),主要內(nèi)容包括:(1)目的基因的挑選。通過(guò)NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及文獻(xiàn)報(bào)道,選擇與研究對(duì)象生長(zhǎng)性狀、肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因。(2)目的基因的擴(kuò)增。利用Primer Premier5.0等軟件設(shè)計(jì)通用引物,引物合成后,混合DNA模板確定引物最佳退火溫度,同時(shí)考察引物擴(kuò)增效率及特異性,舍去擴(kuò)增效率低及有雜片段的引物,采用余下引物對(duì)包含研究對(duì)象樣本分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(3)多序列比對(duì)。對(duì)多樣本目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物做Sanger測(cè)序,通過(guò)SeqMan軟件比對(duì)多樣本相同擴(kuò)增序列,獲得目標(biāo)樣本候選多態(tài)性位點(diǎn)。
分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)是DNA溯源應(yīng)用的關(guān)鍵,研究表明,分子標(biāo)記、基因和性狀之間存在重要的聯(lián)系。通過(guò)SNP分析方法定位數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative Trait Loci,QTL)的研究,以及分子標(biāo)記連鎖群的構(gòu)建及其應(yīng)用,人們對(duì)分子標(biāo)記、基因和性狀三者之間的關(guān)系有了更加全面的認(rèn)識(shí)。在研究基礎(chǔ)上,通過(guò)選擇感興趣的目的基因,可以開(kāi)發(fā)更多新的SNP,使得SNP在動(dòng)植物育種和溯源方面的應(yīng)用更加廣泛。
SNP是單核苷酸突變引起的變異,可以檢測(cè)單核苷酸突變的的方法均可以用于SNP的鑒定。理想的SNP分型方法應(yīng)滿(mǎn)足5個(gè)方面,即對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè)快速準(zhǔn)確;檢測(cè)成本低,開(kāi)發(fā)時(shí)間短;反應(yīng)體系穩(wěn)定,樣品質(zhì)量要求低;數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單準(zhǔn)確;高通量,自動(dòng)化[19~20]。SNP分型方法眾多,幾種主要的SNP檢測(cè)方法及其適用范圍見(jiàn)表1。
SNP作為新一代分子標(biāo)記技術(shù),因其數(shù)量豐富,遺傳穩(wěn)定性高,易于自動(dòng)化分型等諸多優(yōu)點(diǎn),引發(fā)了廣大研究者的濃厚興趣,新的高通量的檢測(cè)方法也不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)。然而,目前的檢測(cè)方法還不能完全滿(mǎn)足以上要求。未來(lái)SNP的檢測(cè)分型方法應(yīng)根據(jù)適用范圍,在更擅長(zhǎng)的領(lǐng)域做更精細(xì)的提升,如在高通量應(yīng)用領(lǐng)域,應(yīng)該更著眼于獲得數(shù)據(jù)的有效性;在中等通量的應(yīng)用領(lǐng)域,更多考慮到中小型實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用需求;在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)領(lǐng)域,應(yīng)朝著簡(jiǎn)便、快速、便攜式方向發(fā)展[9]。

表1 SNP檢測(cè)方法與適用范圍
基于SNP標(biāo)記的肉產(chǎn)品溯源研究由來(lái)已久,而且在某些領(lǐng)域的應(yīng)用已取得成功。用于肉類(lèi)溯源的SNP標(biāo)記應(yīng)用在個(gè)體和種群中具有較高的多態(tài)性、分布廣,且能穩(wěn)定遺傳,檢測(cè)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[35~38]。以往SNP標(biāo)記用于肉產(chǎn)品溯源主要有3個(gè)目的:(1)肉類(lèi)品種的鑒別,即特殊肉產(chǎn)品與普通肉產(chǎn)品的鑒定。(2)個(gè)體來(lái)源的鑒定。(3)產(chǎn)品產(chǎn)地的鑒別,主要是以種間差異和遺傳背景為基礎(chǔ)的品種鑒別,如進(jìn)口肉與本國(guó)肉的鑒定。
(一)肉類(lèi)品種的鑒別DNA技術(shù)的發(fā)展使得分子方法在傳統(tǒng)牛肉溯源中的應(yīng)用成為可能。近年來(lái),微衛(wèi)星已成為最常用的標(biāo)記方法,然而SNPs正在取代它們。近年來(lái),SNP在品種溯源方面的研究眾多,并在一些領(lǐng)域取得了很大成功,比如牛、羊、 豬的品種溯源研究[38~39]。
ZHAO等[40]用10個(gè)SNP標(biāo)記鑒定我國(guó)市場(chǎng)上的牦牛肉和普通牛肉。隨機(jī)選取不同品種的牦牛樣品和普通牛樣品各16份,在普通牛群體中有多態(tài)性但在牦牛中為單態(tài)性的15個(gè)突變位點(diǎn)被確定為SNP候選位點(diǎn)。全部15個(gè)SNP候選位點(diǎn),在16份牦牛樣品中均為純合子,在16份普通牛樣品中既有純合又有雜合。從中選取了10個(gè)SNP位點(diǎn),并設(shè)置了一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照引物對(duì)牦牛進(jìn)行鑒定。牦牛樣品一般產(chǎn)生1~3個(gè)波峰,普通牛樣品在電泳圖譜上有5個(gè)或5個(gè)以上波峰。該方法被成功地應(yīng)用于一種聲稱(chēng)由牦牛制成的產(chǎn)品實(shí)際上是一種普通牛肉產(chǎn)品的鑒別。
SASAZAKI等[41]使用SNP標(biāo)記技術(shù)對(duì)日本本國(guó)牛和進(jìn)口外國(guó)牛進(jìn)行了溯源研究。日本牛樣品446頭,包括日本黑牛和日本荷斯坦牛,進(jìn)口牛樣品388頭,包括美國(guó)牛和澳大利亞牛。按照446頭日本牛中,等位特異性基因只存在于進(jìn)口牛中的標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)格挑選11個(gè)SNP標(biāo)記,對(duì)美國(guó)和澳大利亞牛的鑒定概率超過(guò)9.60×10-2。進(jìn)口牛的高特異性使得日本牛和進(jìn)口牛鑒定的準(zhǔn)確度和可信程度得到保障。
NISHIMURA等[42]對(duì)日本黑牛、F1(日本黑牛×荷斯坦牛)和荷斯坦牛進(jìn)行了SNP的溯源研究。使用樣本(荷斯坦牛2 590頭,日本黑牛1 341頭),用牛SNP50K微珠芯片檢測(cè)了54 001個(gè)SNP,篩選了符合標(biāo)準(zhǔn)的SNP35 844個(gè),分別用PCA分析和線(xiàn)性判別分析的方法對(duì)其作了分析。結(jié)果表明,線(xiàn)性判別法對(duì)標(biāo)記物的判別效果優(yōu)于主成分分析(principal component analysis,PCA),用這個(gè)線(xiàn)性分析式,能將荷斯坦牛與日本黑牛完全鑒定區(qū)分出來(lái),然而做不到荷斯坦牛和F1牛的鑒定,在此臨界值下,日本黑牛被誤判為荷斯坦牛和F1的錯(cuò)誤概率<5.79×10-4。與此同時(shí),荷斯坦牛和F1被誤判為日本黑牛的錯(cuò)誤概率分別<8.00×10-3(F1) 和2.66×10-5(荷斯坦牛)。
KAWAGUCHI等[43]用6個(gè)SNP標(biāo)記鑒別日本本國(guó)和牛和澳大利亞和牛。于新加坡13個(gè)市場(chǎng)購(gòu)得143份澳大利亞和牛樣品,對(duì)47個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行分型處理并使用DigiTag2分析,排除識(shí)別為來(lái)自同一個(gè)體的樣品,最終確定了不同個(gè)體樣品130個(gè)。6個(gè)SNP標(biāo)記從已有研究中選擇[41,44~45], 根據(jù)每個(gè)標(biāo)記的等位基因頻率估計(jì),計(jì)算被鑒定為澳大利亞和牛的概率,對(duì)6個(gè)SNP標(biāo)記的鑒定效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。由6個(gè)SNP標(biāo)記組成的系統(tǒng),從日本本國(guó)和牛和澳大利亞和牛中鑒定出澳大利亞和牛的概率為77.6%,這個(gè)值低于SASAZAKI等[41,44]通過(guò)相同6個(gè)標(biāo)記對(duì)正常澳大利亞牛的概率計(jì)算值9.25×10-1,但可以滿(mǎn)足日本本地和牛與澳大利亞和牛鑒定的要求。
(二)個(gè)體來(lái)源的鑒定傳統(tǒng)的動(dòng)物個(gè)體溯源方法采用的是給動(dòng)物佩戴耳標(biāo)的方式進(jìn)行個(gè)體信息的記錄[46~47],DNA分子標(biāo)記溯源技術(shù)恰好可以彌補(bǔ)動(dòng)物耳標(biāo)及條碼技術(shù)的不足,一是該技術(shù)可以溯源到個(gè)體、品種甚至生物種類(lèi);二是DNA無(wú)法更改,且穩(wěn)定,加工肉制品仍可獲得較高質(zhì)量的DNA[48~49]。因此,將傳統(tǒng)的記錄系統(tǒng)與DNA標(biāo)記技術(shù)有機(jī)結(jié)合,可以真正實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖-屠宰-加工-運(yùn)輸-銷(xiāo)售的全鏈條的溯源[50~51]。
吳瀟等[52]用18個(gè)SNP對(duì)我國(guó)市場(chǎng)上的豬個(gè)體進(jìn)行鑒定。挑選了我國(guó)市場(chǎng)上主要的豬品種共10種、233只(均采自上海崇明富農(nóng)豬場(chǎng)),對(duì)這些豬肉樣品進(jìn)行檢測(cè),共發(fā)現(xiàn)33個(gè)SNP,通過(guò)雜合度計(jì)算進(jìn)一步篩選得到6個(gè)豬肉DNA溯源SNP,分型方法選用內(nèi)切酶的方法。這6個(gè)豬肉的DNA溯源SNP與張小波等[53]研究發(fā)現(xiàn)的12個(gè)豬肉DNA溯源SNP一起使用,理論上能鑒定3.87×108只豬個(gè)體,可以用于大規(guī)模的豬只個(gè)體識(shí)別和追溯。
ZHAO等[54]使用18個(gè)SNP組合,實(shí)現(xiàn)對(duì)我國(guó)市場(chǎng)清真牛個(gè)體鑒定和牛肉追溯。實(shí)驗(yàn)樣品共176個(gè),涵蓋我國(guó)市場(chǎng)上主要的7個(gè)清真牛品種(絕大部分樣品牛個(gè)體為雄性)。檢測(cè)并篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的SNP標(biāo)記59個(gè),運(yùn)用多重?zé)晒釶CR技術(shù),對(duì)7個(gè)不同品種176個(gè)牛個(gè)體DNA組中59個(gè)SNP進(jìn)行分型分析。4個(gè)SNP未檢出棄去,棄去最小等位基因在各自種群中<20%以及在混合物種中<30%的SNP位點(diǎn),最后剩余36個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的SNP。選擇多態(tài)性最高的18個(gè)SNP一起使用,可以實(shí)現(xiàn)任意兩個(gè)清真牛個(gè)體被確定為同一個(gè)體的概率為7.97×10-10,在相同SNP情況下,鑒定效果好于ORRùL等[18]的歐洲牛個(gè)體鑒定的SNP組合。
(三)產(chǎn)品產(chǎn)地的鑒別產(chǎn)品產(chǎn)地的鑒別,主要依據(jù)地理分布差異以及不同遺傳背景造成的動(dòng)物種群差異,利用遺傳標(biāo)記對(duì)存在種間差異的動(dòng)物個(gè)體及種群所屬產(chǎn)地作一鑒定。
ROGBERG-MUNOZ等[55]基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)我國(guó)黃牛牛肉與進(jìn)口牛肉混合樣本進(jìn)行基因組測(cè)序,利用開(kāi)發(fā)的95個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)我國(guó)黃牛和9個(gè)國(guó)外品種牛進(jìn)行聚類(lèi)分析,本研究使用的方法可以正確區(qū)分英國(guó)品種和我國(guó)本地品種,這為利用SNPs檢測(cè)我國(guó)市場(chǎng)上的外國(guó)品種肉類(lèi)提供了可能性。
黃樹(shù)文等[56]基于SNP芯片對(duì)廣東省5個(gè)地方豬種作了遺傳多樣性分析,利用Illumina 60K芯片對(duì)大花白豬、梅花豬、藍(lán)塘豬、粵東黑豬進(jìn)行SNP分型,利用Geenseek 80K芯片對(duì)廣東小耳花豬進(jìn)行SNP分型。其中,梅花豬原為大花白豬的1個(gè)類(lèi)群,但其體型外貌與大花白豬差異較大,為便于分析,將大花白豬和梅花豬作為2個(gè)不同品種進(jìn)行分析。對(duì)照組為杜洛克豬、長(zhǎng)白豬、大白豬、皮特蘭豬4個(gè)西方商業(yè)豬種以及歐洲野豬和亞洲野豬,這些豬種的SNP數(shù)據(jù)均下載自網(wǎng)絡(luò)共享平臺(tái)(http://datadryad.org/)。整合芯片結(jié)果,共獲得31 161個(gè)SNP位點(diǎn)。使用主成分分析對(duì)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,可以將廣東省地方豬種與西方豬種分為2類(lèi),其中,亞洲野豬與廣東省地方豬種聚為一類(lèi),歐洲野豬與西方豬種聚為一類(lèi)。
SNP技術(shù)在肉產(chǎn)品溯源方面的研究具有很大的優(yōu)勢(shì),然而在實(shí)際應(yīng)用方面,要大范圍推廣存在諸多困難,比如動(dòng)物個(gè)體和品種的鑒別,由于樣本種群的地理和遺傳背景差異,初次篩選的SNP位點(diǎn)在不同個(gè)體和群體間的適用性往往不高,通常需要不斷優(yōu)化樣本篩選的方法、擴(kuò)大樣品數(shù)量來(lái)獲得理想的SNP組合。然而隨著研究的不斷深入、相關(guān)領(lǐng)域數(shù)據(jù)庫(kù)的逐步建立,SNP的研究應(yīng)用將逐步走向成熟,以SNP標(biāo)記為特征的肉產(chǎn)品溯源技術(shù),將在今后的溯源應(yīng)用和食品安全保障方面,發(fā)揮更為重要的作用。