不同受精狀態(tài)及發(fā)育中卵裂球數(shù)量對囊胚形成的影響

謝聰聰，郭曉麗，姚冠峰，杜麗榮，張欣，王樹松，王雪瑩

(河北省計劃生育科學技術(shù)研究院，河北省生殖醫(yī)院，國家衛(wèi)生健康委員會計劃生育與優(yōu)生重點實驗室/河北省生殖醫(yī)學重點實驗室，石家莊 050071)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中，大多數(shù)生殖中心在受精后16～18 h評估受精情況，呈現(xiàn)2個原核(pronuclei，PN)和兩個極體(polar body，PB)視為正常受精。通過形態(tài)學評估，包括胚胎的發(fā)育速度、卵裂球數(shù)目、碎片多少、胞質(zhì)均一度等情況，挑選形態(tài)學評分較高的卵裂期胚胎或囊胚進行冷凍或移植。但除2PN胚胎外，還有單原核(1PN)、三原核(3PN)、多原核(多PN)及未見原核(0PN)受精卵，大多IVF治療周期中有足夠的2PN來源胚胎，故非2PN胚胎不作為首選移植，而3PN胚胎予以廢棄處理。事實上，0PN和1PN的異常受精與觀察原核的時間有關(guān)，其中部分異常受精胚胎可能是由于錯過了最佳觀察時機。有文獻報道，患者在移植0PN或1PN的胚胎后，也生育了健康的后代[1]。

本研究將0PN及1PN來源的形態(tài)學優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段，試圖通過延長體外培養(yǎng)的時間來對胚胎進行進一步篩選。比較異常受精胚胎及2PN來源優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚形成情況，探討異常受精胚胎的囊胚形成潛能及其可利用價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2017年1月至 2019年7月在河北省生殖醫(yī)學中心實施IVF的患者周期資料，形態(tài)學評分等同于優(yōu)質(zhì)胚胎的異常受精胚胎及2PN來源的優(yōu)質(zhì)胚胎，將其培養(yǎng)至囊胚，囊胚評分依據(jù)Gardner評分標準[2]。患者納入標準：女方年齡≤35歲，夫婦雙方染色體核型分析均為正常。排除標準：基礎(chǔ)生殖激素水平不正常者，未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)(IVM)周期和獲卵數(shù)≤1的患者。

根據(jù)D1受精狀態(tài)，將胚胎分為3組：0PN組(193個)、1PN組(32個)、2PN組(573個)。再根據(jù)胚胎發(fā)育情況分為A、B、C三個亞組：D2≤3細胞(A1組)、4～6細胞(B1組)和>6細胞(C1組)；D3≤6細胞(A2組)、7～9細胞(B2組)和>9細胞(C2組)。

二、研究方法

1.促排卵方案：根據(jù)卵巢儲備功能情況及血清FSH、LH、E2、P水平選擇方案及Gn啟動劑量，當1～2個卵泡直徑≥18 mm或者3個及以上卵泡直徑≥17 mm時扳機，扳機后35～37 h行陰道超聲引導下取卵術(shù)。除PPOS方案外，其余方案自取卵日開始進行黃體支持。

2.精液處理及受精：精液常規(guī)上游法或密度梯度離心法處理，IVF受精后4～6 h去除卵母細胞周圍的顆粒細胞，置于培養(yǎng)液微滴中觀察卵母細胞成熟度及第二極體的排出情況。胚胎培養(yǎng)采用微滴法培養(yǎng)，受精后16～18 h倒置顯微鏡觀察卵母細胞受精情況。

3.胚胎評分：受精后第3日(D3)對正常受精(2PN)胚胎進行形態(tài)學評分[3]，評分標準分為Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ～Ⅱ級為優(yōu)質(zhì)胚胎。Ⅰ級：8～10細胞；卵裂球大小均勻、形態(tài)規(guī)則，透明帶完整；胞質(zhì)均勻清晰；胚胎內(nèi)碎片<5%。Ⅱ級：≥6細胞；卵裂球大小略不均勻、形態(tài)略不規(guī)則；胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象；胚胎內(nèi)碎片5%～15%。Ⅲ級：D3≥4細胞；卵裂球大小不均勻、可有形態(tài)不規(guī)則；胞質(zhì)可有粗顆粒現(xiàn)象；胚胎內(nèi)碎片16%～25%。Ⅳ級：卵裂球大小極不均勻；胞質(zhì)有嚴重粗顆粒現(xiàn)象；胚胎內(nèi)碎片>30%；或存在多核現(xiàn)象。將優(yōu)質(zhì)胚胎培養(yǎng)至囊胚，囊胚評分依據(jù)Gardner評分標準。優(yōu)質(zhì)囊胚為Gardner評分標準中3期及3期以上，且內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層評分均不含C的囊胚；可利用囊胚定義為Gardner評分標準中3期及3期以上，且內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層評分不同時含C的囊胚。將胚胎培養(yǎng)至第5天(D5)或者第6天(D6)，D5移植或冷凍：根據(jù)胚胎發(fā)育過程，選擇4期及以上的優(yōu)質(zhì)囊胚和可利用囊胚進行移植或冷凍，剩余可繼續(xù)培養(yǎng)至D6；D6移植或冷凍：根據(jù)Gardner評分標準冷凍或移植優(yōu)質(zhì)囊胚和可利用囊胚。

4.觀察指標：觀察不同來源胚胎的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、可利用囊胚率。囊胚形成率=囊胚總數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎總數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎總數(shù)×100%；可利用囊胚率=可利用囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎總數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、0PN組、1PN組及2PN組囊胚形成情況比較

3組的整體囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、可利用囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 囊胚發(fā)育參數(shù)在3組胚胎間的比較(%)

進一步比較了0PN組、1PN組及2PN組間的D5和D6囊胚發(fā)育情況，結(jié)果表明，0PN組D5囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、可利用囊胚率均顯著高于D6(P<0.05)；1PN組D5優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著高于D6(P<0.05)，而D5囊胚形成率、可利用囊胚率與D6無顯著性差異(P>0.05)；2PN組D5優(yōu)質(zhì)囊胚率和可利用囊胚率均顯著高于D6(P<0.05)，D5囊胚形成率與D6無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 囊胚發(fā)育參數(shù)在3組胚胎D5及D6間的比較(%)

二、D2各亞組之間囊胚的培養(yǎng)結(jié)果比較

D2各亞組分析結(jié)果表明，0PN組A1、B1及C1各組囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率和可利用囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)。1PN組A1亞組數(shù)目為1，C1亞組數(shù)目為0，B1亞組囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、可利用囊胚率分別為74.19%、 25.81%、58.06%。2PN組的囊胚形成率上，B1組顯著高于A1組和C1組(P<0.05)，A1亞組顯著高于C1亞組(P<0.05)；可利用囊胚率上B1組顯著高于A1組和C1組(P<0.05)，而三個亞組之間優(yōu)質(zhì)囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 囊胚發(fā)育參數(shù)在D2各亞組間的比較(%)

三、D3各亞組之間囊胚的培養(yǎng)結(jié)果比較

D3各亞組的胚胎發(fā)育結(jié)果分析表明，0PN組在囊胚形成率及可利用囊胚率上，A2組均顯著低于B2和C2組(P<0.05)，且B2組可利用囊胚率也顯著低于C2組(P<0.05)，但3個亞組(A2、B2、C2)之間優(yōu)質(zhì)囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)；1PN組的囊胚形成率B2組顯著高于A2和C2組(P<0.05)，且C2組顯著高于A2組(P<0.05)，而3個亞組之間的優(yōu)質(zhì)囊胚率和可利用囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)；2PN組的可利用囊胚率比較中，A2組顯著低于B2、 C2組(P<0.05)，且B2組顯著低于C2組(P<0.05)，而2PN 3個亞組間的囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 囊胚發(fā)育參數(shù)在D3各亞組間的比較(%)

四、D2 各亞組中不同受精狀態(tài)胚胎的囊胚發(fā)育情況

A1亞組中1PN組的數(shù)目為1，2PN組囊胚形成率、可利用囊胚率顯著高于0PN組(P<0.05)，但兩組間優(yōu)質(zhì)囊胚率無顯著性差異(P>0.05)；B1亞組中3種受精狀態(tài)胚胎的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、可利用囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)；C1亞組中2PN組的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率和可利用囊胚率均顯著低于0PN組(P<0.05)(表5)。

表5 胚胎發(fā)育參數(shù)在D2各亞組中不同受精狀態(tài)胚胎間的比較(%)

五、D3各亞組中不同受精狀態(tài)胚胎的囊胚發(fā)育情況

A2亞組中2PN組囊胚形成率、可利用囊胚率顯著高于0PN組和1PN組(P<0.05)，0PN組和1PN相比無顯著性差異，三組間優(yōu)質(zhì)囊胚率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；B2亞組和C2亞組中3種受精狀態(tài)胚胎的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率和可利用囊胚率之間均無顯著性差異(P>0.05)(表6)。

表6 胚胎發(fā)育參數(shù)在D3各亞組中不同受精狀態(tài)胚胎間的比較(%)

討 論

本文回顧性分析了D1不同受精狀態(tài)胚胎(0PN、1PN、2PN)繼續(xù)培養(yǎng)后囊胚形成情況，發(fā)現(xiàn)形態(tài)較好的0PN、1PN胚胎具有很好的囊胚發(fā)育潛能。常規(guī)IVF周期中0PN胚胎的出現(xiàn)非常常見，原因可能是觀察受精時原核已消失，或者還未出現(xiàn)，其發(fā)生還與女性的年齡、卵母細胞數(shù)量、優(yōu)質(zhì)胚胎比例等顯著相關(guān)[4]。趙雙丹等[5]研究了10 834個IVF周期，其中4 531個周期出現(xiàn)一個或多個0PN胚胎，占IVF周期的 41.82%，0PN胚胎個數(shù)占卵裂期胚胎的18.01%；移植后結(jié)果顯示0PN來源的卵裂期胚胎的妊娠率低于2PN來源的卵裂期胚胎，而0PN來源的囊胚移植妊娠率與2PN來源的囊胚相當。Liu等[4]研究也表明胚胎來源(無論是來自2PN還是來自0PN)對成功率沒有顯著影響。

常規(guī)IVF受精中1PN胚胎的形成原因主要有：原核形成不同步，錯過雙原核的觀察時機或原核融合，因此部分1PN胚胎可能是正常受精胚胎。囊胚培養(yǎng)可以排除部分染色體異常的胚胎，但1PN胚胎的囊胚形成率較低[6]。研究表明，當1PN的原核面積≥710 μm2或直徑≥31 μm時，可獲得與2PN胚胎相似的臨床結(jié)局[7]。Feenan 等[8]認為部分1PN胚胎可培養(yǎng)至囊胚，Li等[9]的研究表明IVF周期中1PN卵裂期胚胎的活產(chǎn)率顯著低于2PN組，但1PN囊胚組的妊娠率與2PN囊胚組相當。Yoshiteru等[10]的研究指出，約80%的1PN胚胎含有二倍體基因組。Liao等[11]對1PN胚胎進行了系統(tǒng)的基因?qū)W檢測后發(fā)現(xiàn)，1PN 胚胎囊胚組的二倍體率明顯高于卵裂期胚胎，說明囊胚的形成過程可排除部分染色體異常的胚胎，與Sandalinas等[12]的研究結(jié)果一致，故囊胚的形成可作為正常受精和染色體正常的一個重要的形態(tài)學參考指標。我們的研究表明，形態(tài)學評分優(yōu)質(zhì)的0PN和1PN胚胎與正常受精胚胎(2PN)的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、可利用囊胚率均無顯著性差異。Fu等[13]的研究顯示，1PN(2Pb)和0PN(2Pb)胚胎的囊胚形成率分別為70.18%和69.17%，形成的囊胚移植后結(jié)局分別為：臨床妊娠率(47.06%和56.25%)、植入率(40.00%和47.62%)、活產(chǎn)率(29.41%和43.75%)和畸形率(0%和0%)，與2PN組結(jié)局無顯著差異。

本文研究結(jié)果顯示，0PN、1PN、2PN三組的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率、可利用囊胚率D5的比率均高于D6。此結(jié)果和王雪等[14]的研究結(jié)果一致，均表明D5組的優(yōu)質(zhì)胚胎比例顯著高于D6組。在凍融單囊胚移植時，若移植胚胎為優(yōu)胚，則囊胚形成時間對于妊娠結(jié)局無顯著影響；但當移植囊胚為非優(yōu)胚時，D5囊胚移植妊娠結(jié)局優(yōu)于D6囊胚移植[15]。幾項大的薈萃分析顯示D5移植后的臨床妊娠率顯著高于D6[16-17]。

研究發(fā)現(xiàn)D2的4細胞是理想的卵裂階段，其著床率明顯優(yōu)于其他細胞數(shù)目[13]。本研究顯示，0PN胚胎，D2 4～6細胞(B亞組)時可獲得較好的囊胚培養(yǎng)結(jié)果。D2 4細胞胚胎的體外發(fā)育能力和體內(nèi)著床潛能優(yōu)于非4細胞胚胎，D2卵裂球數(shù)目>4細胞的優(yōu)質(zhì)胚胎率和著床率高于<4細胞胚胎[18]。宋冰冰等[19]的研究表明，D3卵裂球數(shù)目≤7細胞的胚胎可利用囊胚率低于≥8細胞的胚胎；比較D3卵裂球數(shù)目≤7細胞、8～10細胞、≥11細胞的優(yōu)質(zhì)囊胚率，差異有統(tǒng)計學意義。另有研究比較D3卵裂球數(shù)目≤6細胞、7～10細胞、≥11細胞的優(yōu)質(zhì)囊胚率，差異有統(tǒng)計學[20]。在排除碎片的影響后，囊胚發(fā)育與D3卵裂球數(shù)目有關(guān)，4～6細胞的囊胚形成率最低，而7～9細胞與≥10細胞相比則無差異[21]。本研究結(jié)果和上述以往研究大體一致。D2 4～6細胞胚胎具有較好的囊胚發(fā)育潛能，表明D2的胚胎發(fā)育情況對囊胚的發(fā)育起著重要的作用，并且0PN胚胎D2卵裂球數(shù)目>6細胞時具有較好的囊胚發(fā)育潛能。D3卵裂球數(shù)目≤6細胞時囊胚形成率較低，隨著細胞數(shù)量的增加，可利用囊胚率隨之升高，但并沒有增加優(yōu)質(zhì)囊胚率。因此，胚胎前期發(fā)育速度對后期囊胚的形成起著關(guān)鍵性的作用，可預示囊胚質(zhì)量及后期著床情況。

對于常規(guī)IVF周期中2PN較少或無2PN胚胎的患者，可以將0PN及1PN形態(tài)學較好的胚胎進行囊胚培養(yǎng)，充分知情同意后進行移植或冷凍。由于本研究樣本量小，且沒有追溯后期移植情況，需要進一步擴大樣本分析及長期隨訪工作。今后，我中心將充分利用Timelapse時差培養(yǎng)箱觀察胚胎的動態(tài)發(fā)育過程。