云南小?？Х阮惡诰珶晒饩仃嚬庾V特征

趙林芬，王燕華，王曉婷，弘子姍，劉艷芳，龔加順，譚 超，劉華戎

（云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明 650201）

咖啡是世界三大無酒精飲料之一[1]?？Х鹊淖睾稚饕獊碓从诳Х戎蓄惡诰怯砂肟s醛羥基化合物與氨基化合物發生美拉德反應形成的高分子聚合物[2]。其形成過程尚未明確[3-6]。除咖啡中含有類黑精外，面包等烘焙食品中也含類黑精[7]。烘焙咖啡中類黑精含量約占其干重的16.0%～17.0%[8]?？Х阮惡诰哂幸欢p肥和對肝臟的保護作用[9]，在體內能清除α-二羰基化合物[10]，減少脂質過氧化產物和二次脂氧化產物的合成[11]。但攝入過多會產生活性氧基團，導致細胞死亡和凋亡現象的發生[12]。

目前，類黑精的制備方法主要有醇沉、浸提、大孔樹脂吸附、酶解法等[13-14]。檢測方法主要有高效液相色譜、紫外可見光分光光度法、電噴霧電離質譜和串聯質譜[6,15-16]等。這些檢測方法可靠，但存在設備昂貴和前處理復雜的缺點。三維熒光矩陣光譜分析是一種指紋鑒定技術[17-18]。是由激發波長（y 軸）、發射波長（x 軸）、熒光強度（z 軸）三維坐標所表征的矩陣光譜。表示形式包括等角三維投影圖和三維等高線光譜圖[19]。相對于傳統的檢測方法，三維熒光矩陣光譜分析靈敏度高，選擇性好，樣品需求量少，前處理簡單[20]。主要用于水質污染檢測、食品添加劑、植物油種類的快速鑒別[21-22]。

為研究咖啡類黑精在不同環境條件下的熒光光譜特征變化，本文以云南小粒咖啡為原料提取類黑精，研究咖啡類黑精在不同溫度、不同pH、不同光照及存放時間、不同濃度條件下的熒光光譜特征變化，為咖啡類黑精光譜特征的深入研究提供一定數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南小粒咖啡粉 中度烘焙，廣州伊蘊麗貿易有限公司；實驗室超純水、實驗室純水、市售純凈水、市售山泉水、市政自來水、無水乙醇 天津市風船化學試劑科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸 重慶川東化工集團有限公司；分析試劑 均為AR 級。

PGX-260A 多段可編程光照培養箱 寧波東南儀器有限公司；HH-8 數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；F97Pro 型熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司；SK3200HP 超聲波清洗機 上海科導超聲儀器有限公司；AR224CN 電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 咖啡類黑精的制備 中度烘焙的云南小?？Х确?，按料液比1:2（m/v）加超純水于80 ℃浸提30 min，重復3 次，隨后合并濾液于4000 r/min 離心15 min，取上清液旋轉蒸發至500 mL，咖啡濃縮液與無水乙醇體積比為3:7（v/v），醇沉3 h，再4000 r/min 離心15 min 收集沉淀，最終冷凍干燥得咖啡類黑精粗提物[23]。

1.2.2 三維熒光矩陣光譜（3D-EEMs）及二維熒光矩陣光譜（2D-EEMs）檢測參數設定 3D-EEMs 用于咖啡類黑精指紋光譜特征研究，從中找出咖啡類黑精特征峰；2D-EEMs 基于3D-EEMs 特征峰用于不同溫度、不同pH、不同光照及存放時間、不同濃度條件下的熒光光譜特征變化研究。3D-EEMs 參數設置：掃描波長200～900 nm，激發波長（Excitation wavelength,λex）=200～900 nm，每隔10 nm 激發掃描一次，掃描速度為3×104nm/min，激發帶寬、發射帶寬為10 nm，光電倍增管增益（Photomultiplier Tube,PMT）=900 V，響應時間自動匹配。2DEEMs 參數設置：激發模式下，發射波長（Emission wavelength,λem）=457.8 nm，λex=240～520 nm，掃描速度為300 nm/min，寬帶10 nm，PMT=900 V。發射模式下，λem=377.7 nm，λex=300～700 nm，掃描速度為300 nm/min，寬帶10 nm，PMT=900 V。在兩種模式均為波長掃描，數據方式為熒光模式，相應時間自動匹配，重復1 次，無時間間隔。

1.2.3 水質對熒光光譜圖的影響 對比實驗室超純水、實驗室純水、市售純凈水、市售山泉水、市政自來水的3D-EEMs 光譜圖，篩選出最優沖泡用水。

1.2.4 溫度對咖啡類黑精水溶液熒光強度的影響一杯美式咖啡濃度按100 mg/mL 算，根據咖啡類黑精提取率折算得到一杯美式咖啡中類黑精濃度為2.96 mg/mL。取8 份2.96 mg/mL 的類黑精水溶液，分別在10、20、30、40、50、60、70、80 ℃溫度條件下進行2D-EEMs 測定。

1.2.5 pH 對咖啡類黑精水溶液熒光強度的影響取12 份濃度為2.96 mg/mL 咖啡類黑精水溶液，分別用0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L HCI 調節pH 至1～12 進行2D-EEMs 測定。

1.2.6 不同光照及存放時間對咖啡類黑精水溶液熒光強度的影響 配制2.96 mg/mL 的類黑精水溶液，在避光和光照（3000 Lx）條件下測定0、10、20、30、40、50、60 min 不同時間條件下2D-EEMs 光譜變化。

1.2.7 咖啡類黑精水溶液濃度對其熒光強度的影響

咖啡飲品種類繁多，其中的咖啡類黑精含量也各不相同。類黑精濃度相對較低的咖啡以美式咖啡為代表，類黑精濃度較高的咖啡以意式濃縮咖啡為代表。根據沖泡一杯美式或意式濃縮咖啡的粉水比及烘焙咖啡豆中類黑精含量折算，得到不同咖啡飲品中咖啡類黑精理論濃度范圍約1.08～85.00 mg/mL。設置兩組不同濃度梯度的咖啡類黑精溶液測定熒光強度。低濃度組（0.00～0.50 mg/mL）：稱取咖啡類黑精用超純水配制0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL類黑精水溶液進行2D-EEMs 測定。高濃度組（0.00～60.00 mg/mL）：稱取咖啡類黑精用超純水配制0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00 mg/mL的類黑精水溶液進行2D-EEMs 測定，實際測試中發現咖啡類黑精濃度＞60 mg/mL 無法完全溶解，未對更高濃度咖啡類黑精水溶液熒光強度進行測試。

1.3 數據處理

采用F97Pro 型熒光分光光度計軟件Prolab 6.5.1.3009 進行數據統計和處理，取三次平行結果。

2 結果與分析

2.1 水質對熒光光譜圖的影響

在以水為溶劑的3D-EEMs 光譜圖中，由于入射光子和水中微粒作用會產生干擾性的瑞利散射和拉曼散射[24]。水中可激發熒光的物質越少，則3DEEMs 光譜圖中除瑞利散射、拉曼散射、倍頻峰外的區域越干凈。對比實驗室超純水、實驗室純水、市售純凈水、市售山泉水、市政自來水的3D-EEMs 光譜圖（圖1）。五種不同的水均出現瑞利散射、拉曼散射和倍頻峰線。實驗室超純水的瑞利散射、倍頻峰比其他四種水短，實驗室超純水、實驗室純水、市售純凈水的3D-EEMs 光譜圖均較為清晰，出峰效果較好，說明水中基本無雜質。而市售山泉水在拉曼光譜附近出現細微雜質峰，市政自來水在瑞利散射周圍及倍頻峰（上）附近出現較大雜質峰，說明水中雜質較多。分析時選擇實驗室超純水、實驗室純水或市售純凈水配制類黑精。

圖1 不同溶劑水的三維熒光等高線光譜圖Fig.1 Contour map of 3D-EEMs of water with different solvents

2.2 云南小粒咖啡類黑精3D-EEMs 圖譜特征

3D-EEMs 熒光光譜包含共軛雙鍵的分子信息，可推測溶液中化合物共軛情況。濃度為2.96 mg/mL的類黑精水溶液λex=250～600 nm，λem=300～700 nm范圍內出現熒光峰（圖2）。不同的λex/λem區域對應于不同化合物共軛雙鍵的分子信息：區域Ⅰ（λex/λem=220～250 nm，280～330 nm）為含芳環的蛋白質類，如酪氨酸等低分子物質；區域Ⅱ（λex/λem=220～250，330～380 nm）為可降解的溶解性有機物；區域Ⅲ（λex/λem=220～250 nm，380～550 nm）為富里酸，含有大量碳水化合物，少量芳香基和烷烴；區域Ⅳ（λex/λem=250～340 nm，280～380 nm）為溶解性微生物分解副產物蛋白類物質，如色氨酸；區域Ⅴ（λex/λem=220～250 nm，＞380 nm）為類腐殖質酸，含有羧基和羰基結構[25]。咖啡類黑精3D-EEMs 圖中包含2 個明顯的熒光峰位λex/λem=380 nm，450 nm 和λex/λem=470 nm，525 nm，與上述五區無對應，可能是類黑精水溶液中的各基團相互作用減小了電子之間的能級間距，λex發生紅移。最大λem介于III 區和IV 區附近，推測咖啡類黑精中可能含有羰基、羰基結構或芳香基、烷烴等基團。

圖2 云南小粒咖啡咖啡類黑精水溶液三維等高線光譜圖Fig.2 Contour map of 3D-EEM of aqueous solutions of melanoidins from Yunnan arabica coffee

2.3 溫度對云南小?？Х阮惡诰芤簾晒鈴姸鹊挠绊?/h3>

咖啡類黑精水溶液在10～80 ℃、λex=320～435 nm 范圍內熒光特性具有一定差異（如圖3）。λex=320～340 nm 時咖啡類黑精熒光強度隨著λex增長而緩慢增加，340～400 nm 時咖啡類黑精熒光強度隨著λex增長而急速增加，并在λex=400 nm 時達到峰值，λex＞400 nm 熒光強度逐漸降低，下降趨勢與溫度成反比，溫度越低下降趨勢越明顯；在λex最大時，咖啡類黑精熒光強度峰值與溫度成反比，溫度越低，熒光強度越高。這與尚宏美[26]以及葉君等[27]的研究一致，即溫度升高會使分子運動加快，分子發生更多碰撞釋放更多能量導致用于產生熒光的能量減少、熒光產生效率降低，熒光強度降低。

圖3 溫度對云南小粒咖啡類黑精水溶液熒光強度的影響Fig.3 Effect of temperature on the fluorescence intensity of aqueous solutions of melanoidins from Yunnan arabica coffee

2.4 pH 對云南小?？Х阮惡诰芤簾晒鈴姸鹊挠绊?/h3>

不同pH 條件下咖啡類黑精水溶液在λex=340～430 nm 范圍內的熒光特性，如圖4 所示。pH=4 時熒光強度出現最大值3734.50，λex=397 nm；在pH＜4 的酸性環境中，酸性越強熒光強度越低；pH 在4～5 之間熒光強度從3734.50 迅速降低至約3000；當pH 介于5～10 之間熒光強度平緩，溶液pH=7 時達到此段高點，在此范圍內溶液堿性越強，熒光強度越低，在pH=9～10 熒光強度無明顯變化；當pH＞10，熒光強度突然急劇下降發生熒光猝滅現象，至pH=12 時熒光強度最低為132.50。pH 變化不僅會改變溶液酸堿度，也會影響溶質分子的熒光，pH 變化會導致帶有酸性或堿性取代基的大多數芳香族化合物溶液電離平衡發生移動，導致熒光強度和光譜發生變化。其根本原因是當分子的酸堿度發生變化時，分子結構的變化是不同的，當分子處于不同的pH 時，其吸收和發射熒光的能力會受到影響，熒光光譜會有所不同[26]。

圖4 pH 對云南小?？Х阮惡诰芤簾晒鈴姸鹊挠绊慒ig.4 Effect of pH on the fluorescence intensity of aqueous solutions of melanoidins from Yunnan arabica coffee

2.5 不同光照及存放時間對云南小?？Х阮惡诰芤簾晒鈴姸鹊挠绊?/h3>

咖啡類黑精水溶液在避光和3000 Lx 光照下，隨著存放時間的增加，溶液熒光強度發生變化（圖5）。避光存放30 min 的類黑精水溶液熒光強度緩慢增加，30～40 min 熒光強度逐漸降低，40 min 后熒光強度隨避光時間增加而逐漸增加，避光50 min 后熒光強度達到最大值3792.00，但總體來看避光存儲的類黑精水溶液在60 min 內熒光強度變化不顯著（P＞0.05）。在3000 lx 光照條件下，隨存放時間增加咖啡類黑精水溶液熒光強度逐漸降低，60 min 時熒光強度最低為3148.50，且與0 min 時對比顯著降低（P＜0.05）。當咖啡類黑精分子被特定波長的光持續照射，吸收被照射光的能量并脫離原來的穩定狀態，熒光強度隨之下降。

圖5 不同光照及存放時間對類黑精水溶液熒光強度的影響Fig.5 Effects of the different lighting and storage time on fluorescence intensity of aqueous solutions of melanoidins from Yunnan arabica coffee

2.6 不同濃度云南小?？Х阮惡诰芤旱臒晒鈴姸?/h3>

云南小?？Х阮惡诰芤涸?.00～0.50 mg/mL濃度條件下，溶液濃度與熒光強度呈線性關系，y=7492x+213.5（R2=0.9846）（見圖6）。隨著類黑精濃度增高至20.0 mg/mL，溶液中類黑精濃度增大，聚合物配體的結構穩定性隨類黑精交聯度的增加而變化，配體的能級不再匹配，配體的能量轉移效應降低，發光效率降低，熒光強度降低。部分熒光被類黑精自身吸收，導致熒光猝滅，使得咖啡類黑精熒光強度陡然下降。

圖6 不同濃度云南小粒咖啡類黑精水溶液的熒光強度Fig.6 Effects of the different concentration on fluorescence intensity of Melanoidin aqueous solution

3 結論

以中度烘焙的云南小粒咖啡為原料制備類黑精，研究不同溫度、不同pH、不同光照及存放時間、不同濃度條件下的熒光光譜特征變化。結果表明，在10～80 ℃范圍云南小粒咖啡類黑精水溶液熒光強度與溫度成反比；pH 介于5～10 之間的類黑精水溶液熒光強度較為穩定；避光存儲的類黑精水溶液在60 min 內熒光強度變化不顯著（P＞0.05），而光照時間增加會導致熒光強度顯著下降（P＜0.05）；在濃度小于0.5 mg/mL 時，類黑精水溶液熒光強度與濃度成正比，相關系數為0.9846，濃度大于10 mg/mL 時會發生熒光猝滅，類黑精水溶液熒光強度與濃度不相關。