富集鈣乳酸菌的篩選及培養條件對富集效果的影響

石 月，王金廂，李學鵬,2,*，勵建榮，李婷婷，郭曉華，黃建聯，丁浩宸

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，國家魚糜及魚糜制品加工技術研發分中心，遼寧錦州 121013；2.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，大連工業大學，遼寧大連 116034；3.大連民族大學生命科學學院，遼寧大連 116600；4.山東美佳集團有限公司，山東日照 276800；5.遼寧安井食品有限公司，遼寧鞍山 361003）

鈣是地殼礦質元素中第五豐富的元素，也是人體必需營養素之一。人體內含鈣量約為1000～1300 g，其中99%存在于骨骼和牙齒中，其余的1%分布在血液、細胞外液、軟組織中，用于維持細胞正常生理功能，與骨鈣保持動態平衡。目前，缺鈣是人類的普遍現象。鈣缺乏可導致佝僂病、骨質疏松癥等，嚴重者可導致肌肉痙攣、心臟衰竭。傳統補鈣制劑主要分為無機鈣和有機鈣，無機鈣主要來源于碳酸鈣、動物鮮骨、貝殼等，價格低廉，來源廣泛，但吸收效率低，溶解性差；有機鈣主要包括葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、醋酸鈣等，這類鈣較無機鈣容易吸收，但成本較高，氨基酸螯合鈣在一定程度上可以提高生物利用度，但易造成脂肪氧化[1]。近年來，有益微生物對于鈣的富集和轉化成為該領域的研究熱點。

Tang 等[2]通過對草魚骨的酶解、發酵，發現經過發酵的草魚骨液能夠促進大鼠的生長發育，鈣能夠在大鼠體內得到良好的吸收利用。韓克光等[3]對羊骨進行發酵，發酵后的骨液釋放出更多的鈣，體外抗氧化活性顯著提高。Hu 等[4]利用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌共同發酵豬骨，發現經發酵后骨液中鈣的含量提高到0.9942%。徐穎等[5]研究了乳酸菌富集硒的效果，張青松[6]研究了乳酸菌富集鋅的特性，翟齊嘯[7]研究了乳酸菌吸附鎘以減除危害作用。乳酸菌具有良好的吸附金屬離子能力，可以增強有益金屬的作用，降低有害金屬的毒性。利用乳酸菌富集鈣，可以克服傳統無機鈣不易吸收、吸收量低等問題。

魚骨是魚類水產品加工過程中產生的主要副產物之一，通常與內臟等其他下腳料一起被簡單加工成魚粉等低值飼料，經濟效益低[8]。魚骨中鈣含量豐富（高達20%～30%），是一種天然優質的鈣源，因此可通過深加工制成補鈣制劑、膳食營養強化劑和高鈣食品等高附加值產品，為水產品加工副產物的綜合利用提供可行路徑[9]。但魚骨中的鈣質一般以羥基磷灰石結晶形式存在，且羥基磷灰石鈣與膠原纖維有機結合，導致骨鈣自然溶出量甚微，鈣元素的利用率低。采用益生菌發酵可將魚骨中的無機鈣轉化為有機鈣，對于有效利用魚骨中的鈣具有重要意義。鑒于此，本文研究篩選富集鈣能力強的乳酸菌，提高鈣富集量，并優化鈣富集條件，初步探索結合機制，為進一步將乳酸菌用于魚骨發酵制備有機鈣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌CY1-1、植物乳桿菌Z7、戊糖片球菌DBY2-5-1、干酪乳桿菌D400、米酒乳桿菌DL10、嗜酸乳桿菌DL12、清酒乳桿菌YP4-5 以上菌株由本實驗室保藏。MRS 肉湯 青島海博生物技術有限公司；乙二胺四乙酸、氯化鈣 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

THERMO 高速冷凍離心機 美國Thermo 公司；DL-CJ-2N 超級潔凈工作臺 北京市東聯哈爾儀器制造有限公司；CHA-S 恒溫振蕩器 上海梅香儀器制造有限公司；SPX-25 生化培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；GI54DS 立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；XE-70 原子力顯微鏡 韓國Park Systems公司；MS105UD 電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；Imark 酶標儀 美國BIORAD 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的活化與培養 取凍存于甘油中的乳酸菌，在MRS 肉湯培養基中接種2%進行活化，在37 ℃恒溫培養24 h，連續培養三代，用于后續實驗。

1.2.2 生長曲線的測定 參考吉莉莉等[10]的方法略有修改，將活化后的乳酸菌按2%的接種量接種于MRS 肉湯中，在37 ℃恒溫培養24 h，每隔2 h 取樣，將菌液取200 μL 置于96 孔板中，以空白培養基為對照，用酶標儀測定吸光值OD595，根據OD595繪制生長曲線。

1.2.3 產酸能力的測定 參考陳銘[11]的方法略有修改，將活化后的乳酸菌按 2%的接種量接種于MRS 肉湯中，在37 ℃條件下恒溫培養24 h，每隔6 h進行取樣測定乳酸含量。取發酵液3 mL 置于錐形瓶中，按1:3 的比例加入蒸餾水，用標定的0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液進行滴定，將總的可滴定酸轉換成乳酸含量：

式中：W，發酵液含量，mL；N，NaOH 標準溶液濃度，mol/L；V，NaOH 消耗量，mL；K，0.09 為乳酸轉化系數。

1.2.4 乳酸菌對鈣的富集實驗 參考陳宇凌等[12]和張付云等[13]的方法略有修改，將發酵物8000 r/min離心20 min 收集菌體，再用超純水將菌體洗滌兩次，獲得濕菌體備用。將濕菌體重懸于滅菌后鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的氯化鈣溶液中進行富集，37 ℃重懸2 h，再經8000 r/min，20 min 離心除去菌體，利用EDTA 滴定法測定上清液中鈣離子的含量[13]，每個樣品重復測定三次。

式中：鈣富集量，mg/g；鈣離子總量、上清液中鈣離子含量，mg；菌體質量，g。

1.2.5 乳酸菌對鈣富集條件的優化 將乳酸菌活化三代，單一菌株按2%接種量接入培養基中，37 ℃下恒溫培養24 h；復合菌株按1:1 的比例、2%接種量接入培養基中，37 ℃恒溫培養24 h。在4 ℃條件下，8000 r/min，離心20 min 獲得菌體，再用超純水洗滌兩次，獲得濕菌體備用。

1.2.5.1 培養時間對乳酸菌富集鈣的影響 將乳酸菌活化三代，單一菌株按2%的接種量接入鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的MRS 液體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h；復合菌株按1:1 的比例、2%接種量接入鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的MRS 液體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h。測定菌株的生長曲線，按照生長曲線選取對數期和穩定期。

對各乳酸菌進行擴培，在對數期和穩定期進行鈣富集量的測定。取一定量的乳酸菌，在1.2 mg/mL的氯化鈣溶液中37 ℃重懸2 h，在4 ℃條件下，8000 r/min，離心20 min 去除菌體，利用EDTA 滴定法測定上清液中的鈣離子濃度，鈣富集量的計算同1.2.4。

1.2.5.2 鈣離子濃度對乳酸菌富集鈣的影響 將乳酸菌活化三代，單一菌株按2%的接種量接入鈣離子濃度為0、0.6、1.2、1.8 mg/mL 的MRS 液體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h；復合菌株按1:1 的比例、2%接種量接入不同鈣離子濃度的MRS 液體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h。以空白培養基為對照，用酶標儀測定吸光值OD595，根據OD595繪制生長曲線，觀察含鈣離子的培養基對乳酸菌生長情況的影響。

稱取一定量的氯化鈣，溶于超純水，調節溶液中鈣離子濃度分別為0.6、1.2、1.8 mg/mL，將于正常培養基中培養的濕菌體重懸于不同濃度氯化鈣溶液中，以菌體重懸于超純水中作為空白對照，37 ℃重懸2 h；再經離心去除菌體，利用EDTA 滴定法測定上清液中的鈣離子濃度，并計算出乳酸菌的鈣富集量及鈣轉化率。

式中：鈣離子轉化率，%；鈣離子總量、上清液中鈣離子含量，mg。

1.2.5.3 不同pH 對乳酸菌富集鈣的影響 配制鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的氯化鈣溶液，初始pH 為7.2，利用HCl 調節pH 為6、5、4、3，將濕菌體重懸于不同pH 的氯化鈣溶液中，37 ℃重懸2 h；再經離心去除菌體，測定上清液中的鈣離子濃度，并計算出乳酸菌的鈣富集量。

1.2.5.4 培養溫度對乳酸菌富集鈣的影響 配制鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的氯化鈣溶液，將濕菌體重懸于不同溫度的氯化鈣溶液中，35、37、40、42 ℃重懸2 h；再經離心去除菌體，利用EDTA 滴定法測定上清液中的鈣離子濃度，并計算出乳酸菌的鈣富集量。

1.2.6 原子力顯微鏡觀察微觀結構 以植物乳桿菌CY1-1 為實驗菌株，將濕菌體在鈣離子濃度為1.2 mg/mL 和空白試劑中37 ℃重懸2 h，重懸后離心收集菌體。將獲得的濕菌體稀釋200 倍，取1 滴置于蓋玻片中央，自然干燥后在原子力顯微鏡下檢測，掃描范圍為2.5 μm×2.5 μm。

1.3 數據統計分析

所有實驗均重復3 次，采用SPSS19.0 軟件進行方差分析，以Duncan’s 法進行檢驗，利用 Origin 2018進行作圖，Gwyddion 2.53 對圖片進行處理。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

圖1 為七種乳酸菌的生長曲線。由圖可以看出，七種乳酸菌的生長趨勢大致相同，均呈先上升后平緩的趨勢。在對數生長期（4～12 h）生長情況較好的是嗜酸乳桿菌，干酪乳桿菌的生長情況滯后于其余乳酸菌。進入穩定期后各乳酸菌的差異逐漸縮小，此階段生長情況最好的是植物乳桿菌CY1-1，這可能是由于植物乳桿菌具有廣泛性、普遍性，生長穩定，干酪乳桿菌生長情況較其余菌株差。

圖1 七種乳酸菌的生長曲線圖Fig.1 Growth curve of seven kinds of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌的產酸能力測定

產酸能力是衡量乳酸菌品質的重要指標，優良的乳酸菌應兼具有良好的生長能力與產酸能力，從而提高發酵的產品風味與營養價值[14]。本研究對七種乳酸菌的產酸能力進行測定，結果如圖2。根據圖2可知，隨著培養時間的延長，各乳酸菌產酸量逐漸上升，培養24 h 后七種乳酸菌產酸量由大到小依次為：嗜酸乳桿菌DL12＞植物乳桿菌CY1-1＞米酒乳桿菌DL10＞清酒乳桿菌YP4-5＞植物乳桿菌Z7＞戊糖片球菌DBY2-5-1＞干酪乳桿菌D400。乳酸菌的產酸速率與生長速率具有一致性，嗜酸乳桿菌具有較強的產酸和耐酸能力，產酸量較高；戊糖片球菌及干酪乳桿菌的生長情況滯后于其余菌株，產酸能力亦稍低于其余菌株。

圖2 七種乳酸菌的產酸曲線Fig.2 Acid production curve of seven kinds of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌富集鈣能力的測定

將七種乳酸菌在鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的氯化鈣溶液中進行培養，以溶液中鈣離子濃度差與乳酸菌濃度之比顯示為鈣富集的差異。從圖3 可以看出，各菌株對鈣的富集有明顯差異，鈣富集量在17.01 到45.41 mg/g 間不等，之前亦有實驗表明，乳酸菌對金屬離子的富集有差異[15-16]。七種乳酸菌中鈣富集量最高的是植物乳桿菌CY1-1，其鈣富集量為45.41 mg/g，其次為植物乳桿菌Z7，鈣富集量為37.9 mg/g。為探討乳酸菌復合發酵對鈣富集能力的影響，選取以上兩種乳酸菌與其余五株菌進行復合，研究復合菌株的鈣富集能力。

圖3 七種乳酸菌鈣富集量Fig.3 Calcium enrichment of seven lactic acid bacteria

2.4 復合菌株富集鈣能力及產酸能力的測定

復合菌株的富集鈣能力與產酸量如圖4 所示。從圖3 中可以看出植物乳桿菌Z7 的鈣富集量為37.9 mg/g，經復合后，Z7+DL12 組合低于單菌富集量，其余組均高于單一菌種富集量。植物乳桿菌CY1-1 鈣富集量45.4 mg/g，經復合后，CY1-1+DL10、CY1-1+YP4-5 組合低于單一菌種富集量，其余組鈣富集量均得到提升。文獻表明，乳酸菌復合可能存在競爭抑制，產生負相互作用，使復合菌體濃度下降[17]。而植物乳桿菌CY1-1 和嗜酸乳桿菌DL12 復合菌株，植物乳桿菌Z7 和清酒乳桿菌YP4-5 復合菌株，在鈣富集量和乳酸含量上均有提升。因此，接下來的試驗，選擇植物乳桿菌CY1-1、植物乳桿菌Z7、植物乳桿菌CY1-1 和嗜酸乳桿菌DL12 復合、植物乳桿菌Z7 和清酒乳桿菌YP4-5 復合菌株作為試驗菌株進行鈣富集條件的優化。

圖4 復合菌種富集鈣能力及乳酸產量Fig.4 Calcium enrichment capacity and lactic acid production of composite strains

2.5 乳酸菌富集鈣的影響因素研究

2.5.1 培養時間對乳酸菌富集鈣的影響 為了研究時間對乳酸菌富集鈣的影響，將四組實驗菌株（CY1-1、CY1-1+DL12、Z7、Z7+P4-5）接種于含Ca2+含量為 1.2 mg/mL 的MRS 培養基中，37 ℃恒溫培養24 h，每隔2 h 進行取樣測定生長曲線。根據生長曲線（圖5），各組乳酸菌在4～10 h 生長迅速，在14～24 h生長趨勢基本平緩，故選取8 和22 h 為時間點進行實驗，研究對數期、穩定期的菌株富集鈣的差異。將乳酸菌培養8 和22 h，收集并洗滌菌體，將菌體重懸于氯化鈣溶液中進行鈣富集實驗，測定結果如圖6所示，可以看出對數期的菌株富集鈣含量要低于穩定期。對數期鈣富集量約占穩定期的80%～90%，這可能是在細胞增殖過程中，鈣與細胞器結合，蛋白質和多糖等物質含有的氨基、羧基、羥基等基團，能與金屬離子發生相互作用[18]，而在穩定期乳酸菌生長穩定、生物累積量較大，鈣離子通過載體進入細胞或與特定物質結合[19]，從而完成鈣的富集作用，因此鈣富集量要高于對數期。

圖5 單菌、復合菌株生長曲線Fig.5 Growth curves of single and composite strains

圖6 培養時間對鈣富集量的影響Fig.6 Effect of incubation time on calcium enrichment

2.5.2 鈣離子濃度對乳酸菌富集鈣的影響 將四組乳酸菌分別接種在鈣離子濃度為0、0.6、1.2、1.8 mg/mL的培養基中，對四種乳酸菌的生長曲線進行測定。從圖7 可以看出，各菌株隨著鈣離子濃度的升高，乳酸菌的生長能力均有所降低。這可能是由于培養基中成分比較復雜，含有K+、Na+、Mg2+等金屬離子，而高濃度鈣離子的存在，阻礙乳酸菌與其他金屬陽離子結合[20-21]，導致生長能力下降。另外高濃度的金屬離子可能對菌體產生毒害或抑制作用，從而使生長量降低[22-23]。根據圖8 可知，隨著鈣離子濃度的升高，鈣富集量有所提升。這是因為在氯化鈣溶液中進行富集，溶液中僅有一種金屬陽離子——鈣離子，不存在其他金屬離子競爭，菌體的基團結合位點基本上都被鈣離子占據，所以富集量較高。植物乳桿菌CY1-1+嗜酸乳桿菌DL12 組富集量在鈣離子含量為1.8 mg/mL 時低于1.2 mg/mL 組，這可能是由于鈣離子濃度過高，抑制了該復合菌株的離子富集，導致富集量降低。根據鈣轉化率來看，只有植物乳桿菌Z7+清酒乳桿菌YP4-5 組合的轉化率和鈣離子濃度成正比，這可能是菌株復合后吸附鈣離子能力提高，沒有因為濃度增大而出現富集量的降低，且該組的鈣富集量遠高于其余組合，故轉化率有所提升。其余三組鈣轉化率最高的均為鈣離子含量為1.2 mg/mL組。結合乳酸菌生長趨勢、鈣富集量、鈣轉化率得出，適合乳酸菌富集的鈣離子濃度為1.2 mg/mL。

圖7 乳酸菌在不同鈣離子濃度下的生長曲線Fig.7 Growth curves of lactic acid bacteria at different calcium ion concentrations

圖8 乳酸菌在不同鈣離子濃度下的鈣富集量和轉化率Fig.8 Calcium enrichment and conversion rate of lactic acid bacteria at different calcium ion concentrations

2.5.3 不同pH 對乳酸菌富集鈣的影響 pH 是影響生物吸附金屬離子的重要因素之一[24-25]，在較低的pH 下，由于氫離子競爭結合位點，導致乳酸菌與其他離子的結合數量下降。隨著pH 的升高，細胞表面官能團的負電荷增加，從而有利于離子與乳酸菌的結合。如圖9 所示，Z7 和CY1-1+DL12 組中，pH 在3～5 范圍內的趨勢是pH 越小，鈣富集量越多，這可能是由于酸性條件下有利于鈣離子的溶出，使鈣離子更多的暴露在溶液中與乳酸菌進行富集。從四組菌株整體看，最優富集量出現在pH 為5、6 和初始的pH（7.2），這是因為植物乳桿菌的最適pH 在6.2～6.6 的范圍內[26]。從圖中可以看出，Z7 的最適pH 為6，CY1-1+DL12組的最適pH 為7.2，Z7+YP4-5和CY1-1 組在pH 為5 和7.2 相差不多。

圖9 pH 對乳酸菌鈣富集量的影響Fig.9 Effect of pH on calcium enrichment of lactic acid bacteria

2.5.4 培養溫度對乳酸菌富集鈣的影響 乳酸菌最適發酵產酸溫度是40～42 ℃，而最適生長溫度是35～37 ℃[27]。實驗選擇35、37、40、42 ℃培養實驗菌株，在鈣離子含量為1.2 mg/mL 中的氯化鈣溶液中進行富集，比較富集鈣效果。從圖10 可以看出，溫度對于各組間鈣富集量的影響具有一定差異，四組乳酸菌總體趨勢為隨著溫度升高鈣富集量呈先上升后下降趨勢。其中Z7+YP4-5 組的最適溫度為37 ℃，其余三組的最適溫度為40 ℃。Mrv?ic 等[28]研究溫度對于乳酸菌富集鋅的影響，結果顯示乳酸菌富集鋅的能力隨著溫度的升高而提高，原因可能是溫度影響了菌體的活性或乳酸菌與金屬結合物的穩定性。

圖10 培養溫度對鈣富集量的影響Fig.10 Effect of culture temperature on the enrichment of calcium

2.6 原子力顯微鏡觀察富集前后菌體變化

原子力顯微鏡（AFM）可以在接近生理條件的溶劑體系中直接觀測生物分子的表面特征，可用于表征不同軟度的生物樣品甚至活體細胞，并且具有樣品處理簡單、圖像重復性強、力學靈敏度高和空間分辨率高的優勢，是研究生物學的有力工具[29-31]。以植物乳桿菌CY1-1 為觀察對象，觀察乳酸菌富集鈣前后菌體細胞變化。圖11 顯示的是植物乳桿菌富集鈣前后原子力顯微鏡微觀結構的影響，在三維形貌圖中，較暗的區域為表面較低的部分，較亮的區域為表面較高的部分[32]，可以看出，乳酸菌富集鈣后的顏色差異較大，細胞表面高度差較大；正常乳酸菌表面凸起形狀平坦圓滑，富集后的凸起形狀尖銳，說明乳酸菌在與鈣結合后聚集顆粒大且多。綜上所述，乳酸菌富集鈣離子后，菌體表面聚集了大量鈣離子，致使細胞形態與正常菌株差異較大。

圖11 原子力顯微鏡觀察乳酸菌富集鈣前后菌體細胞變化Fig.11 Atomic force microscopy observation of changes in bacterial cells before and after calcium enrichment by lactic acid bacteria

3 結論

本文對七種乳酸菌的生長能力、產酸能力、富集鈣能力進行了測定，篩選出鈣富集量最高的是植物乳桿菌CY1-1，富集量為45.41 mg/g；其次為植物乳桿菌Z7，富集量為37.9 mg/g。將以上兩種菌株與其他乳酸菌菌株復合，結果表明植物乳桿菌Z7+清酒乳桿菌YP4-5 復合菌株，植物乳桿菌CY1-1+嗜酸乳桿菌DL12 復合菌株在鈣富集量和乳酸含量上均有提升。選取以上四種組合進行富集條件優化，分別考察了培養時間、鈣離子濃度、pH、溫度對鈣富集量的影響，結果顯示在穩定期進行富集，最適鈣離子濃度為1.2 mg/mL，Z7 的最適pH 為6，Z7+YP4-5、CY1-1、CY1-1+DL12 組的最適pH 為7.2，Z7+YP4-5 組的最適溫度為37 ℃，其余各組的最適溫度為40 ℃。利用原子力顯微鏡觀察乳酸菌富集鈣前后菌體細胞，結果表明乳酸菌富集鈣前后細胞形態差異較大，是鈣離子在乳酸菌中的富集導致的。后續可將篩選出的鈣富集能力強的乳酸菌用于魚骨等天然富鈣原料的發酵，提取其中的鈣離子，用于制備新型補鈣制劑。