一種葡萄釀酒活性干酵母簡(jiǎn)便制備法

李東歌，劉紅艷，葉冬青，秦 義,3，孫 悅，許引虎，劉延琳,3,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧 530007；3.中國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，寧夏銀川 750021；4.寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院/寧夏葡萄與葡萄酒研究院，寧夏銀川 750021；5.湖北省酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443003）

釀酒活性干酵母是現(xiàn)代高新技術(shù)融合發(fā)展的一種生物活性制品，具有發(fā)酵性能優(yōu)良、細(xì)胞耐性強(qiáng)、絮凝性好、保存期長(zhǎng)、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。在葡萄酒生產(chǎn)中，釀酒活性干酵母是葡萄酒的關(guān)鍵輔料，優(yōu)良的釀酒活性干酵母能使葡萄酒發(fā)酵的過(guò)程穩(wěn)定易控，促進(jìn)葡萄漿果優(yōu)良品質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中最大限度的表達(dá)，從而獲得高品質(zhì)的葡萄酒[2]。其性能的優(yōu)劣不僅決定了葡萄酒發(fā)酵能否順利進(jìn)行，更會(huì)對(duì)葡萄酒的質(zhì)量，特別是葡萄酒口感和風(fēng)味產(chǎn)生顯著影響[3-4]。近年來(lái)隨著“微生物風(fēng)土”概念的提出和被葡萄酒行業(yè)普遍接受，亟需一種設(shè)備投入要求低、簡(jiǎn)便的釀酒活性干酵母制備方法來(lái)進(jìn)行特定釀酒活性干酵母的制備，以滿足具有地域特色風(fēng)格的葡萄酒產(chǎn)品開(kāi)發(fā)需求[5]。

生產(chǎn)釀酒活性干酵母主要是對(duì)其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而培養(yǎng)獲得活性強(qiáng)且生物量高的酵母，再采用較為溫和的方式進(jìn)行干燥，以獲得高活性的干酵母制品。酵母菌在生長(zhǎng)過(guò)程中受到巴斯德效應(yīng)（The Pasteur Effect）和克雷布特效應(yīng)（The Crabtrec Effect）的雙重調(diào)節(jié)，嚴(yán)格優(yōu)化培養(yǎng)基成分和含量對(duì)高生物量的獲得十分關(guān)鍵[6]，流加培養(yǎng)的關(guān)鍵在于對(duì)培養(yǎng)條件和補(bǔ)料方式進(jìn)行優(yōu)化，以保證培養(yǎng)過(guò)程始終處在最佳的狀態(tài)[7]。發(fā)酵罐是酵母培養(yǎng)重要的生物反應(yīng)器，工業(yè)化活性干酵母的制備方法大多采用“發(fā)酵罐-流化床”體系進(jìn)行制備。新型發(fā)酵罐基本上是圍繞傳氧效率、攪拌系統(tǒng)、使用材料三者的綜合考慮[8]，而搖瓶培養(yǎng)只需要控制轉(zhuǎn)速、溫度等簡(jiǎn)單條件。生產(chǎn)釀酒活性干酵母干燥過(guò)程是將酵母細(xì)胞脫水使之進(jìn)入一個(gè)新陳代謝臨時(shí)可逆、暫停的低濕休眠狀態(tài)[9]，其中熱風(fēng)干燥、真空干燥、噴霧干燥和流化床干燥等[10-11]是常用的方法。與其它干燥方法相比，熱風(fēng)干燥操作簡(jiǎn)單、成本低，對(duì)于中小微企業(yè)來(lái)說(shuō)能夠帶來(lái)更好的經(jīng)濟(jì)收益。熱風(fēng)干燥是將物料置于連續(xù)流動(dòng)的空氣流中，使物料中的水分不斷蒸發(fā)的過(guò)程[12]。發(fā)酵罐生產(chǎn)對(duì)于小微企業(yè)生產(chǎn)活性干酵母成本相對(duì)較高，所以“搖瓶-烘箱”體系更加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

為了滿足實(shí)驗(yàn)室或大量中小型企業(yè)對(duì)小批量制備特定本土活性干酵母的需求，本研究以?xún)?yōu)選釀酒酵母菌株wh-2-8 為試驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行基于“搖瓶-烘箱”平臺(tái)的釀酒活性干酵母的制備研究，優(yōu)化發(fā)酵工藝和干酵母制備工藝，得到最佳培養(yǎng)時(shí)間、酵母最佳鼓風(fēng)干燥時(shí)間，保護(hù)劑最佳添加量等，以期為小批量簡(jiǎn)便制備活性干酵母提供技術(shù)方法和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄 2018 年采于寧夏，成熟度良好，總糖232.52 g/L，總酸（以酒石酸計(jì)）5.32 g/L，pH 3.48；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)wh-2-8 保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院釀酒微生物種質(zhì)資源室；搖瓶種子培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextros，YEPD）液體培養(yǎng)基、葡萄糖 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉 四川西隴科學(xué)有限公司；果膠酶 沃爾森公司；亞硫酸 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；海藻糖 上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉、果膠酶 均為分析純。

BK1301 生物顯微鏡 南京庚辰科學(xué)儀器有限公司；Cary60 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 安捷倫科技有限公司；ELX800 酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek 公司；NRY-2110 恒溫?fù)u床 上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；HDS-16-5 鹵素電子水分儀 上海方瑞儀器有限公司；GNP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TDL-40B 高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；CS1013 電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶試驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)菌種活化 將保存于-80 ℃冰箱的釀酒酵母wh-2-8 菌株于無(wú)菌狀態(tài)下用接種環(huán)挑取一環(huán)在平板培養(yǎng)基上劃線，用封口膜封口，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

活化后接于裝有200 mL 種子培養(yǎng)基的搖瓶，在轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度30±1 ℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，挑選穩(wěn)定期前期至對(duì)數(shù)期后期的節(jié)點(diǎn)作為接種時(shí)間點(diǎn)。

1.2.2 搖瓶增殖培養(yǎng) 將培養(yǎng)至最佳時(shí)間的種子液在無(wú)菌狀態(tài)下按搖瓶裝液量體積的10%進(jìn)行接種，在轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度30±1 ℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4 h 取樣監(jiān)測(cè)，并及時(shí)加入400 g/L 葡萄糖溶液和1 mol/L NaOH 溶液進(jìn)行補(bǔ)料，使葡萄糖含量維持在20 g/L 的水平，pH 維持在5～6 的水平。

1.2.2.1 搖瓶裝液量?jī)?yōu)化試驗(yàn) 在500 mL 錐形瓶中加入培養(yǎng)基的量分別設(shè)定為100、150、200、250 mL，測(cè)定OD600nm，分析不同裝液量對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響，并確定最佳搖瓶裝液量。

1.2.2.2 補(bǔ)料方式優(yōu)化試驗(yàn) 以最佳搖瓶裝液量進(jìn)行接種培養(yǎng)，設(shè)定3 組補(bǔ)料方式，A 組：進(jìn)行碳源補(bǔ)加并調(diào)節(jié)pH 在5～6 的水平；B 組：只進(jìn)行碳源補(bǔ)加；C 組：不進(jìn)行補(bǔ)料。測(cè)定OD600nm，分析三種補(bǔ)料方式對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響，確定最佳補(bǔ)料方式。

1.2.3 菌體鼓風(fēng)干燥 將增殖培養(yǎng)完成后干重達(dá)到最大時(shí)的酵母培養(yǎng)液進(jìn)行離心，在得到的酵母菌體中加入保護(hù)劑，分置于90 mm 的玻璃皿，放入鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行干燥。將干燥完成的酵母活性干粉封藏于密封袋中，放于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.1 保護(hù)劑添加量?jī)?yōu)化試驗(yàn) 離心獲得的酵母泥，以海藻糖為保護(hù)劑，添加量（以干重計(jì)）設(shè)定為5%、8%、10%，放置于36 ℃條件下進(jìn)行干燥，每隔1 h 取樣進(jìn)行水分含量的測(cè)定，以水分含量≤5.5%來(lái)確定干燥時(shí)間。分析不同保護(hù)劑添加量對(duì)酵母菌體的活菌率影響，確定最佳保護(hù)劑添加量。

1.2.3.2 鼓風(fēng)干燥溫度優(yōu)化試驗(yàn) 在選定的最佳保護(hù)劑添加量的基礎(chǔ)上，設(shè)定干燥溫度分別為30、33、36、40、45 ℃，每隔1 h 取樣進(jìn)行水分含量的測(cè)定，以水分含量≤5.5%來(lái)確定干燥時(shí)間。分析不同干燥溫度對(duì)酵母菌體活菌率的影響，確定最佳干燥溫度。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定方法 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法進(jìn)行葡萄糖濃度的測(cè)定[13]；光密度測(cè)定：于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液光密度值OD600nm；細(xì)胞干重測(cè)定：離心所得菌體恒溫烘干至質(zhì)量恒定；酵母細(xì)胞數(shù)檢測(cè)法：用顯微鏡血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。復(fù)水活化活菌率按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 活性干酵母發(fā)酵性能檢驗(yàn) 將赤霞珠葡萄進(jìn)行除梗破碎，裝入2.5 L 玻璃容器中（設(shè)置3 組平行：罐號(hào)1、2、3），按照1 mg/L 的添加量添加6%亞硫酸并混合均勻，后于葡萄醪中加入30 mg/L 果膠酶，24 h后加入已用葡萄汁活化好的wh-2-8 釀酒活性干酵母粉，接種量為6.80×106個(gè)/mL，進(jìn)行浸漬發(fā)酵。

在發(fā)酵過(guò)程中，每12 h 進(jìn)行一次壓帽，每隔24 h進(jìn)行一次殘?zhí)堑臏y(cè)定。在發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行殘?zhí)恰⒕贫取]發(fā)酸、pH 及總酸的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；Minitab 18 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間分析采用One-Way ANOVA 法；Origin 9.5 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母wh-2-8 生長(zhǎng)特征

釀酒酵母wh-2-8 的生長(zhǎng)呈現(xiàn)典型的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)（圖1），從培養(yǎng)開(kāi)始至10 h 為生長(zhǎng)延滯期，10～20 h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，20 h 后處于酵母的生長(zhǎng)穩(wěn)定期。考慮到菌株的數(shù)量和活力，選擇處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期至穩(wěn)定期前期的22 h 作為釀酒酵母wh-2-8 種子液培養(yǎng)的最佳時(shí)間，此時(shí)的活細(xì)胞數(shù)為1.47 × 107個(gè)/mL。

圖1 釀酒酵母種子液生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of S.cerevisiaeseed liquid

2.2 搖瓶裝液量的選擇

比較不同裝液量對(duì)釀酒酵母wh-2-8 生長(zhǎng)量的影響，其結(jié)果如圖2 所示。24～48 h 酵母處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)較快；而在52～96 h 酵母生長(zhǎng)開(kāi)始出現(xiàn)衰亡，因?yàn)檎{(diào)節(jié)pH 和糖導(dǎo)致?lián)u瓶中溶氧越來(lái)越低，所以酵母生長(zhǎng)量開(kāi)始降低。通過(guò)對(duì)比可知：初始裝液量越少，相同時(shí)間內(nèi)菌體生長(zhǎng)量越高。因此，綜合考慮菌體總積累量以及培養(yǎng)時(shí)間，確定在500 mL 錐形瓶中裝液量200 mL 作為搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)的條件。

圖2 不同裝液量下酵母的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of yeast with different liquid volume

2.3 補(bǔ)料方式與培養(yǎng)時(shí)間的選擇

搖瓶培養(yǎng)條件下，進(jìn)行碳源分批補(bǔ)加以及發(fā)酵pH 控制（圖3）。進(jìn)行碳源分批補(bǔ)料、pH 調(diào)節(jié)的（A 和B）生長(zhǎng)量在48 h 達(dá)到穩(wěn)定期，而不進(jìn)行碳源和pH 調(diào)節(jié)的（C）在32 h 達(dá)到穩(wěn)定期；200 mL 裝液量條件下，補(bǔ)加碳源并調(diào)節(jié)pH 時(shí)（A）的菌體生長(zhǎng)量高于其它兩組補(bǔ)料方式（B、C），OD600nm最大可達(dá)到56.23；只補(bǔ)加碳源（B）的條件下，酵母生長(zhǎng)低于補(bǔ)加碳源并調(diào)節(jié)pH 組（A），OD600nm最大值為52.22；不進(jìn)行補(bǔ)料（C）組的菌體最大OD600nm僅為34.57。因此，有利于搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)的補(bǔ)料方式為進(jìn)行碳源補(bǔ)加并調(diào)節(jié)pH。

圖3 不同補(bǔ)料方式酵母生長(zhǎng)曲線Fig.3 Curves of feeding ways on biomass of S.cerevisiae

在選定的補(bǔ)料方式的基礎(chǔ)上，以菌體濃度指標(biāo)，選擇搖瓶培養(yǎng)的時(shí)間，以獲得在最佳生物活性狀態(tài)下的最大菌體濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酵母菌體干重在55 h達(dá)到最大值17.80 g/L，活菌數(shù)5.68×108個(gè)/mL，OD600nm達(dá)到54.95（圖4）。因此綜上所述，基于“搖瓶”的釀酒酵母較優(yōu)的培養(yǎng)條件為：YEPD 為發(fā)酵培養(yǎng)基、搖床轉(zhuǎn)速250 r/min、培養(yǎng)溫度30±1 ℃、間歇補(bǔ)料維持葡萄糖在20 g/L 水平、pH 5～6 水平，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為55 h。

圖4 搖瓶間歇補(bǔ)料培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of batch culture in shake flask

2.4 鼓風(fēng)干燥保護(hù)劑添加量的確定

選擇最常用的鼓風(fēng)干燥箱作為探究活性干酵母的干燥設(shè)備。干燥條件對(duì)酵母菌體活性影響較大，而保護(hù)劑可以在制備酵母活性干細(xì)胞過(guò)程中能起到保護(hù)作用，有效地提高活菌率[14]。相關(guān)研究表明海藻糖對(duì)酵母具有較好的保護(hù)效果[15]，本研究探究了三種濃度下海藻糖對(duì)干酵母的保護(hù)作用，結(jié)果如圖5 所示。保護(hù)劑的含量從5%提高到8%時(shí)，活菌率顯著提高（P＜0.05），而8%的添加量與10%的添加量的活菌率分別為70.16%和71.02%，并無(wú)明顯提高，考慮到生產(chǎn)中實(shí)際的經(jīng)濟(jì)效益，所以選擇保護(hù)劑的添加量是8%。

圖5 不同保護(hù)劑添加量的活菌率Fig.5 Livingcell rate of different protective agent additions

2.5 鼓風(fēng)干燥溫度和時(shí)間的確定

在確定保護(hù)劑用量為8%的基礎(chǔ)上，設(shè)定一系列溫度梯度，探究不同干燥溫度和時(shí)間對(duì)活性干酵母活菌率的影響，結(jié)果如表1 所示。在30～36 ℃條件下，活菌率隨著溫度的升高而有所升高；而超過(guò)36 ℃，溫度越高，活菌率反而越低。在36 ℃干燥12 h 的條件下，活菌率達(dá)到最大值71.05%，干粉水分含量在5.15%，符合國(guó)標(biāo)GB/T 20886-2007[16]對(duì)活性干酵母含水量（≤5.5%）的要求。

表1 不同鼓風(fēng)干燥溫度下活菌率和含水量Table 1 Living cell rate and water content at different air drying temperatures

2.6 釀酒活性干酵母基本質(zhì)量指標(biāo)

對(duì)所制備的活性干酵母的基本質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)（表2）。制備的釀酒活性干酵母指標(biāo)中除了活細(xì)胞率略低于國(guó)標(biāo)GB/T 20886-2007 的80%外[16]，其它質(zhì)量指標(biāo)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可達(dá)到實(shí)驗(yàn)室階段簡(jiǎn)便制備小批量活性干酵母的目的，具有實(shí)際使用價(jià)值。

表2 釀酒活性干酵母基本質(zhì)量指標(biāo)Table 2 Quality indicators of active dry yeast

2.7 發(fā)酵性能檢測(cè)

使用制備的釀酒活性干酵母進(jìn)行干紅葡萄酒的發(fā)酵試驗(yàn)（圖6）。釀酒酵母wh-2-8 在啟酵后的24～96 h 內(nèi)能夠迅速將糖代謝轉(zhuǎn)化成酒精，啟酵迅速，且發(fā)酵過(guò)程平穩(wěn)，符合釀酒酵母發(fā)酵特性。發(fā)酵結(jié)束所得干紅葡萄酒基本理化指標(biāo)如表3 所示。3 個(gè)酒樣之間理化指標(biāo)穩(wěn)定性較好，殘?zhí)蔷∮? g/L，酒度達(dá)12%（V/V）以上，揮發(fā)酸遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（1.2 g/L）[17]，說(shuō)明所制備的活性干酵母發(fā)酵性能良好，可用于實(shí)際葡萄酒的釀造生產(chǎn)。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中還原糖變化Fig.6 Change of reducing sugar content during fermentation

表3 干紅葡萄酒基本理化指標(biāo)Table 3 Basic physical and chemical indexes of dry red wine

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)釀酒活性干酵母工藝的優(yōu)化，建立了對(duì)“搖瓶-烘箱”體系的釀酒活性干酵母簡(jiǎn)便制備方法，對(duì)比“發(fā)酵罐-流化床”體系，“搖瓶-烘箱”體系滿足了試驗(yàn)研究和普通小微企業(yè)簡(jiǎn)便制備特色釀酒活性干酵母的需求。

在搖瓶增殖培養(yǎng)工藝上，通過(guò)補(bǔ)加碳源和控制發(fā)酵過(guò)程pH 的方式，使得酵母細(xì)胞干重最高可達(dá)17.80 g/L 的水平，明顯優(yōu)于前人搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果[18-19]。趙小麗等[18]通過(guò)對(duì)釀酒酵母有氧發(fā)酵條件進(jìn)行探究、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵條件，優(yōu)化后的菌體干重為9.63 g/L；南博[19]通過(guò)對(duì)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的探究獲得的最終菌體量為11 g/L。上述研究中，菌體量較低的原因可能是在培養(yǎng)過(guò)程中搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，從而導(dǎo)致生產(chǎn)過(guò)程中溶氧較低，影響了酵母生長(zhǎng)量[20]，同時(shí)也沒(méi)有進(jìn)行補(bǔ)料，這也導(dǎo)致了后期酵母因營(yíng)養(yǎng)缺失停止生長(zhǎng)[21]。本文通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)速的控制提高，采用補(bǔ)料的方式，最終提高了釀酒活性干酵母的生物量。

在干燥階段工藝上，選擇了最常見(jiàn)的鼓風(fēng)干燥箱作為酵母菌體的干燥設(shè)備，所得到的較優(yōu)結(jié)果條件下的酵母活菌率已達(dá)71.05%，相較于同樣使用海藻糖做單一保護(hù)劑的研究結(jié)果[22-23]，本試驗(yàn)雖略低于80%，但其發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒殘?zhí)切∮? g/L，酒度達(dá)12%（V/V）以上，揮發(fā)酸遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（1.2 g/L）性能[24-25]，具有良好的發(fā)酵性能。多數(shù)的研究表明，復(fù)合保護(hù)劑的添加更有利于提高活菌率[26-30]，后續(xù)可進(jìn)行不同保護(hù)劑的復(fù)配使用以進(jìn)一步提高活菌率。綜上，本研究通過(guò)對(duì)活性干酵母制備工藝的優(yōu)化，為實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行小批量釀酒活性干酵母的簡(jiǎn)便制備提供技術(shù)方法和理論依據(jù)。