等離子體活化水對沙門氏菌的滅活作用及機制研究

相啟森，張 嶸，杜桂紅，王利敏，蔣愛民

（1.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642；2.河南大用實業有限公司，河南鶴壁 456750；3.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450001；4.開封大用實業有限責任公司，河南開封 475000）

食源性致病菌污染是影響食品安全的重要因素，嚴重威脅人類健康[1]。我國每年都會發生由沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌等引起的集體性食物中毒事件，嚴重威脅消費者健康[2]。近年來，非熱殺菌技術由于操作溫度低，能夠較大程度保持食品品質而受到廣泛關注[3]。目前，針對食品中微生物污染問題，常用的非熱殺菌技術包括超高壓、脈沖電場、紫外線殺菌等，這些殺菌方法具有一定的功效，但同時也有一些弊端[4-8]。例如紫外線的穿透能力較低，因此對待處理樣品的類型、色澤等有一定要求，這也限制了紫外線殺菌技術的應用范圍[9]；而超高壓殺菌技術成本較高[4,10]。

等離子體活化水（Plasma-activated water，PAW）是一種新型非熱殺菌技術，主要通過低溫等離子體在水表面或水下放電而產生，具有作用均勻、綠色環保等優點[11]，近年來已被廣泛應用于食品殺菌保鮮領域[12]。研究證實，PAW 的抗菌活性與等離子體放電過程中產生的一些活性成分（包括電離氣體、分子、帶電粒子、負離子/正離子、自由基等）緊密相關[13]，但對于PAW 殺菌作用機理的研究尚不充分[14]。因此本研究擬以沙門氏菌（S.typhimurium）為研究對象，評價PAW 的殺滅效果，并通過評價細胞形態、細胞膜通透性和胞內活性氧水平等指標分析其作用機理，研究結果將為PAW 在食品保鮮領域中的應用提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌（S.typhimurium，CICC 21484）中國工業微生物菌種保藏中心；營養瓊脂和營養肉湯 北京奧博星生物技術有限責任公司；乙酸異戊酯、磷酸二氫鉀 天津市科密歐化學試劑有限公司；碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、50%戊二醛和N-苯基-1-萘胺（N-Phenyl-1-naphthylamine，NPN）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）上海源葉生物科技有限公司。

TS-PL200 型等離子表面處理機 深圳東信高科自動化設備有限公司；MJ-54A 型高壓滅菌鍋 施都凱儀器設備（上海）有限公司；TGL-16M 型臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；Tecan Spark 20 M 型多功能微孔板讀數儀 瑞士Tecan 公司；JSM-6490LV 型掃描電子顯微鏡日本JEOL 公司；Nano Drop 2000 型超微量分光光度計 美國Thermo 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備 從-80 ℃冰箱中取出甘油管保存的菌種，挑取一環菌液在營養瓊脂培養基上反復活化培養后，挑取活力旺盛的單菌落接種于營養肉湯液體培養基中，于37 ℃、120 r/min 恒溫振蕩培養12 h。取30 mL 培養物于50 mL 離心管，于4 ℃、4000×g離心10 min，棄上清液，所得菌體用0.85%無菌NaCl溶液洗滌2 次，離心同上述條件。將所得菌體重懸于0.85%無菌NaCl 溶液中并混勻，制成活菌數約為7～8 lg CFU/mL 的菌液備用。

1.2.2 PAW 的制備 采用大氣壓等離子體射流（Atmospheric pressure plasma jet，APPJ）裝置制備PAW，其功率750 W，工作氣體為壓縮空氣（0.18 MPa）。將300 mL 無菌去離子水（Sterile distilled water,SDW）經APPJ 裝置處理30、60 和90 s 得到的PAW 分別記為PAW30、PAW60 和PAW90，備用。

1.2.3 PAW 對S.typhimurium殺菌效果評價 將100 μLS.typhimurium菌懸液加入裝有900 μL PAW 的離心管中，混勻，于室溫處理不同時間（0、2、4、6、8 和10 min）。取100 μL 處理后的樣品，用0.85%無菌NaCl 溶液進行梯度稀釋后，吸取100 μL稀釋液加入到營養瓊脂平板并涂布，于37 ℃培養箱中培養12 h，進行菌落計數并計算，結果表示為lg CFU/mL，每個稀釋度均重復3 次。

1.2.4S.typhimurium細胞形態觀察 參考Xiang 等[15]的方法，采用掃描電鏡（Scanning electron microscope,SEM）觀察PAW 處理對S.typhimurium細胞形態的影響。菌懸液經PAW60 處理10 min 后，于4 ℃、12000×g離心2 min，收集菌體，加入500 μL 預冷的2.5%戊二醛溶液，避光，并于4 ℃冰箱固定4 h；然后于4 ℃，8000×g 離心6 min，收集樣品，棄固定液，后用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗滌樣品三次，離心同上；后分別用30%、50%、70%、80%、90%、100%（v/v）乙醇溶液對樣品逐級洗脫10 min，其中100%乙醇溶液洗脫2 次；最后用乙酸異戊酯洗滌置換乙醇2 次，每次10 min，離心條件同上，棄上清，制備菌懸液，混勻之后滴加到洗凈晾干的載玻片上，自然晾干，采用HVB-GB 型真空蒸鍍儀噴金150 s，并通過掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 胞外蛋白及核酸含量測定S.typhimurium菌懸液經PAW60 處理不同時間后，于4 ℃，12000×g離心2 min，并收集上清液。采用Nano Drop 2000型超微量分光光度計測定上清液中蛋白及核酸含量，每組重復三次，結果均表示為μg/mL。

1.2.6 細胞質膜通透性測定 采用碘化丙啶（PI）探針評價細胞膜通透性的變化情況[16]。S.typhimurium菌懸液經PAW60 處理不同時間（2、4、6、8 和10 min）后，于4 ℃、12000×g 離心2 min，棄上清液，加入PI 儲備液（終濃度為3.0 μmol/L）并于暗處（室溫）孵育15 min，于4 ℃、8000×g 離心2 min，棄上清，菌體用0.85%無菌NaCl 溶液洗滌兩次，重懸。后立即采用多功能微孔板讀數儀測定熒光強度，激發波長為540 nm，發射光波長為630 nm，以未處理的樣品為對照組。細胞膜相對通透率計算公式如下：

式中：F1為PAW 處理組細胞熒光強度，F0為對照組細胞熒光強度。

1.2.7 細胞外膜完整性測定 采用NPN 熒光探針檢測PAW 處理對S.typhimurium細胞外膜的影響[17]。S.typhimurium菌懸液經PAW60 處理不同時間（2、4、6、8 和10 min）后，于4 ℃，12000×g 離心2 min，棄上清液，后加入適量0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）重懸，加入NPN 儲備液（終濃度為10 μmol/L），置于室溫暗處孵育10 min。采用多功能微孔板讀數儀測定熒光強度，激發波長為350 nm，發射波長為401 nm。按式（2）計算相對熒光強度：

式中：F1為PAW 處理組細胞熒光強度，F0為對照組細胞熒光強度。

1.2.8 細胞內活性氧水平測定 參考馬良軍等[18]的方法并稍作改動。S.typhimurium菌懸液經PAW60處理不同時間（2、4、6 和8 min）后，于4 ℃，12000×g離心2 min，棄上清液，并重懸于磷酸鹽溶液（0.1 mol/L、pH7.2），洗滌三次，離心同上，后加入適量DCFH-DA 染色液，于37 ℃暗處孵育1 h，后在激發光/發射光為488/525 nm 波長條件下測定樣品熒光強度。按式（1）計算相對熒光強度。

1.3 數據處理

每次試驗均重復3 次，試驗結果表示為平均值±標準差。采用Prism 軟件（Graphpad 7.0）繪圖，采用SPSS 軟件（Version24.0）進行ANOVA 單因素方差分析和最小顯著差異法Ducan 檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 PAW 對S.typhimurium 的殺菌效果

由圖1A 可知，經60、90 s 放電時間PAW 處理6 min后，S.typhimurium活菌數顯著降低（P＜0.05）。與對照組相比，經PAW30、PAW60 和PAW90 分別處理6 min 后，S.typhimurium活菌數分別降低0.63、1.78 和4.32 lg CFU/mL。結合前期研究結果，考慮到耗能因素且通過優化PAW60 處理時間也能達到良好的殺菌效果，因此采用PAW60 進行后續實驗研究。如圖1B 所示，隨著PAW60 處理時間的延長（2～10 min），S.typhimurium活菌數顯著降低（P＜0.05）。與對照組相比，經PAW60 處理10 min 后，S.typhimurium活菌數由初始的7.91 lg CFU/mL 降低至3.69 lg CFU/mL，減少了4.22 lg CFU/mL。以上結果表明，PAW 能夠有效滅活S.typhimurium，其殺菌效果受低溫等離子體激活時間和處理時間影響較大。

圖1 放電時間（A）和反應時間（B）對PAW 殺滅S.typhimurium 效果的影響Fig.1 Effects of discharge time (A) and treatment time (B) on inactivation efficacy of PAW against S.typhimurium cells

2.2 PAW 對S.typhimurium 細胞形態的影響

采用掃描電子顯微鏡觀察PAW 處理對S.typhimurium細胞形態的影響。如圖2 所示，對照組S.typhimurium細胞呈桿狀，表面完整光滑；經PAW60 處理10 min 后，S.typhimurium菌體出現不規則鋸齒形輪廓，并且菌體表面出現明顯的褶皺和破裂，這與朱莉華等[19]的結果一致。以上結果表明，PAW 處理破壞了細菌細胞形態，可能進一步影響其正常生理代謝。

圖2 PAW60 處理對S.typhimurium 細胞形態的影響Fig.2 Effect of PAW60 treatment on the morphology of S.typhimurium cells

2.3 PAW 對S.typhimurium 細胞膜通透性的影響

通過測定核酸、蛋白質等胞內物質的釋放評價PAW 處理對S.typhimurium細胞膜通透性的影響。由圖3A 可知，在處理時間為0 至10 min 時，S.typhimurium胞外核酸含量隨著PAW60 處理時間的延長而顯著增加（P＜0.05）。PAW60 處理10 min后上清液中核酸含量為7.33 μg/mL，顯著高于對照組（P＜0.05）。如圖3B 所示，隨PAW60 處理時間延長，S.typhimurium胞外蛋白質釋放量顯著升高（P＜0.05）；經PAW60 處理10 min 后，胞外蛋白質濃度升高至72.00 μg/mL。以上結果表明PAW 處理可造成S.typhimurium細胞膜結構發生改變，從而顯著增強其細胞膜通透性（P＜0.05），造成核酸及蛋白質等胞內組分釋放到胞外。

圖3 PAW60 處理對S. typhimurium 核酸（A）和蛋白釋放量（B）的影響Fig.3 Effects of PAW60 treatment on nucleic acids (A) and proteins (B) leakages of S.typhimurium

2.4 PAW 對S.typhimurium 細胞膜通透性的影響

碘化丙啶（PI）是一種疏水性核酸染料，當細胞膜受損或通透性改變時，PI 會進入細胞內并與核酸結合后發出紅色熒光[20]。由圖4 可知，與對照組相比，隨著PAW60 處理時間延長，S.typhimurium細胞中PI 熒光強度顯著增強（P＜0.05），這與Xiang 等[21]的研究結果一致。當處理時間為10 min 時，S.typhimurium細胞PI 熒光強度相對于對照組升高了84.58%。以上結果表明PAW 處理顯著增強了S.typhimurium細胞質膜的通透性（P＜0.05），造成胞內核酸、蛋白質等物質釋放到胞外，影響正常代謝而造成細胞死亡[22]。

圖4 PAW60 處理對S.typhimurium 細胞中PI 熒光強度的影響Fig.4 Effect of PAW60 treatment on PI fluorescence intensity of S.typhimurium cells

2.5 PAW 對S.typhimurium 細胞外膜完整性的影響

革蘭氏陰性菌（如S.typhimurium）由內膜和外膜兩層膜包被[23]，完整的外膜作為滲透屏障可以保護細菌不受環境中有害化合物的損害[24]。NPN 是一種疏水性熒光探針，只能在親水溶液中發出微弱熒光，不能有效穿過細菌細胞的外膜，但一旦細菌外膜受損，它就可以進入外膜的疏水性環境（膜內部磷脂層），其熒光強度顯著增強[25]。因此，NPN 被廣泛用于評價細菌外膜通透性變化[17]。

如圖5 所示，與對照組相比，S.typhimurium細胞中NPN 熒光強度隨PAW60 處理時間的延長而逐漸增強（P＜0.05）。經PAW60 處理10 min 后，S.typhimurium細胞中NPN 熒光強度升高了316.81%。細胞外膜通透性的增強常伴隨著膜的破壞和裂解。已有研究表明，經熱和PAW 處理后，細菌細胞的NPN 熒光強度顯著增強[26]。綜上所述，PAW60 處理造成S.typhimurium細胞外膜滲透性增強，這可能是其死亡的重要原因[27]。

圖5 PAW60 處理對S.typhimurium NPN 熒光強度的影響Fig.5 Effect of PAW60 treatment on NPN fluorescence intensity of S.typhimurium

2.6 PAW 對S.typhimurium 胞內活性氧水平的影響

在等離子體放電過程中會產生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS），如臭氧（O3）、一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）和羥基自由基（·OH）等。這些活性物質轉移到水中，可以誘導細菌細胞膜脂質發生氧化反應，同時活性物質還可以擴散到細胞內，進一步氧化蛋白質和核酸等物質，誘導細胞發生氧化應激反應，從而破壞細胞的正常生理功能[28]。采用DCFH-DA 探針檢測PAW60 處理對S.typhimurium胞內ROS 含量的影響。如圖6 所示，在處理時間為0～8 min 時，S.typhimurium胞內ROS 水平隨PAW60處理時間的延長而逐漸升高。經PAW60 處理8 min后，S.typhimurium胞內活性氧水平相對于對照組升高了114.07%。ROS 過度積累會對胞內脂類、蛋白質和DNA 等生物分子造成氧化損傷，導致細菌的生物膜和細胞生理功能被破壞，最終造成細胞死亡[29]。

圖6 PAW60 對S.typhimurium 胞內活性氧水平的影響Fig.6 Effect of PAW60 on the intracellular reactive oxygen levels of S.typhimurium cells

3 結論

本研究通過等離子體放電不同時間得到PAW30、PAW60 和PAW90，發現隨著放電時間的延長，PAW 對S.typhimurium殺菌效果逐漸增強。經PAW60 處理10 min 后，S.typhimurium活菌數減少了4.22 lg CFU/mL；PAW60 處理后，S.typhimurium細胞形態發生明顯變化，細胞膜通透性增強，并且胞內活性氧水平顯著升高，這些可能是PAW 處理造成S.typhimurium失活的重要作用機制。在今后的研究中應綜合運用代謝組學、轉錄組學、蛋白質組學等方法系統闡明PAW 失活微生物的分子機制；此外，還應系統評價PAW 對食品表面微生物的殺滅效果及對食品營養和感官品質的影響。