改性殼聚糖復合膜的制備及優化

李金星，沈春紅，黎先發

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621000）

殼聚糖是一種天然高分子聚合物，具有良好的成膜性和抗菌性，以及許多獨特的物理化學特性和生物功能，由于殼聚糖分子間和分子內的氫鍵導致溶解性差以及抑菌性不足等影響，使得它的應用在一定程度上受到了限制[1]。利用殼聚糖分子中游離的氨基和羥基能進行許多化學反應，可以對殼聚糖進行化學改性，這些衍生物都具有良好的成膜性、吸濕性[2]、粘附性[3]和生物可降解性[4]等。

巰基化殼聚糖，不僅具有殼聚糖本身的優異性質，還具有良好的水溶性，改善了殼聚糖不溶于水的局限，應用范圍更廣，此外其具備強大的粘附性[5-6]且無生物毒性。殼聚糖上巰基的接入方式有很多，合成方法大都是在殼聚糖的氨基上接含巰基的基團。Kast 等[7]將巰基乙酸（TGA）在碳二亞胺的作用下，以共價方式連接到殼聚糖上，由此制備的巰基化殼聚糖表現出高達10 倍的粘附性改善，這是通過在聚合物的伯氨基和TGA 的羧酸基之間形成酰胺鍵來實現的；Kafedjiiski 等[8]用S-乙酰硫代亞胺酸異丙酯對殼聚糖進行化學修飾，通過硫醇基團的固定化，粘液糖蛋白與粘液糖蛋白形成二硫鍵，大大改善了粘液粘附性；王凱麗[9]以生物體內唯一含有巰基基團的半胱氨酸的乙酰產物N-乙酰-L-半胱氨酸為親水基團，對殼聚糖進行改性，合成具有更好粘附性、生物相容性和無毒副作用的巰基殼聚糖衍生物。盡管進行了化學修飾，但它們仍然是可生物降解的，并表現出良好的溶脹行為。巰基化殼聚糖不僅在生物醫藥方面作為醫用敷料及藥物載體具有廣闊的前景[10]，在水果保鮮方面，作為新型水果保鮮劑，可制備為固體保鮮劑，也可制備為保鮮液涂膜于水果表面[11]，表現出明顯的保鮮作用。

單一的可食膜存在機械性能不足以及抑菌效果差等問題，在一定程度上限制了應用范圍，為了解決這個問題，目前最常用的方法就是將單一膜進行復合改性，利用物質之間的相互作用，提高膜的機械性能以及抑菌性能。為了提高膜的機械性能，通常將兩種或兩種以上的多糖、蛋白質共混，將不同的成膜材料采用物理或化學的方法根據不同的比例復配，結合不同成膜材料的優點，改善單一成膜材料的性能，從而得到具有優良性能的復合膜材料[12]。結冷膠是一種帶負電荷的線性胞外多糖，具有獨特的凝膠特性和溶液流變學性質[13]，以及良好的生物相容性和降解性。天然結冷膠主鏈上接有酰基，所形成凝膠柔軟、富有彈性、且黏著力強。此外，結冷膠膜機械性能和透明度較好，結構穩定[14]。結冷膠作為帶負電荷的多糖，它可以與殼聚糖等帶相反電荷的聚合物產生聚電解質。殼聚糖聚合物本身在低pH 條件下的不穩定性限制了其應用，其后果是生物活性化合物比預期更早釋放。殼聚糖的穩定性可通過與陰離子多糖如結冷膠的絡合來提高，這種陰離子多糖在低pH 下能抑制藥物釋放[15]。Shukla 等[16]以聚乙二醇（PEG）為交聯劑合成的結冷膠接枝殼聚糖水凝膠，在藥物包封率、溶脹度、緩釋性能和傷口愈合應用方面顯示出巨大的效果。Liu 等[17]制備了殼聚糖纖維接枝結冷膠水凝膠，含有豐富的極性和親水性氨基，具有較高的活化能，力學性能和持水性能優良，可用于制備支架材料。甘油作為增塑劑對膜的柔韌性和阻隔性能有重要的影響，增加膜結構的完整性[18]。氯化鈣作為交聯劑能夠增強膜的機械性能，提高膜的穩定性[19]。鈣離子在植物生長發育、成熟衰老等生理生化方面具有重要的作用，用于李[20]、葡萄[21]、梨[22]、棗[23]等水果保鮮中，可保持果實的硬度，延緩后熟衰老，降低腐爛率、維持果實品質。納他霉素作為抑菌劑，無臭無味，對幾乎所有霉菌和酵母菌具有抑制作用[24]。雖然殼聚糖與結冷膠的復配多有研究，常應用于生物醫藥方面[25-26]，而巰基化殼聚糖與結冷膠復配制備高性能復合膜尚未見報道，因此本研究為巰基化殼聚糖與結冷膠的復配在水果保鮮領域的應用提供理論依據。

本研究以殼聚糖為原料，利用殼聚糖上的氨基與N-乙酰L-半胱氨酸的羧基反應脫去一分子水，使兩者鍵合到一起，從而使殼聚糖上連接上巰基，得到巰基化殼聚糖。以巰基化殼聚糖為成膜基質，添加結冷膠、甘油、氯化鈣以及納他霉素，制備機械性能良好的巰基化殼聚糖復合膜，為進一步研究該復合膜在水果保鮮中的應用提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 食品級，河南信和生物科技有限公司；結冷膠、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）上海麥克林生化科技有限公司；甘油、氯化鈣 分析純，成都市科龍化工試劑廠；納他霉素 食品級，河南圣斯德實業有限公司；6-氯-1-羥基苯并三氮唑（HOBt）、1-（3-二甲基氨丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDAC）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

DF-101 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；FreeZone2.5真空冷凍干燥機 美國Thermo Electron 公司；C45.504溫控式電子萬能材料試驗機 美特斯工業系統（中國）有限公司；UV-8000S 紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；艾瑞澤數顯千分尺 青島易購五金工具有限公司；DHG-9145A 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；KQ5200B 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巰基化殼聚糖的制備 參考王凱麗[9]巰基化殼聚糖的制備方法。

1.2.2 巰基化殼聚糖中巰基含量的測定 參考王凱麗[9]巰基化殼聚糖中巰基含量的測定方法。

1.2.3 單一膜及巰基化殼聚糖復合膜的制備 通過溶液流延法制成。單一殼聚糖膜的制備，將0.2 g 殼聚糖置于100 mL 去離子水中，攪拌至溶解，得到殼聚糖膜液，然后超聲脫氣30 min，取20 mL 殼聚糖膜液傾倒在90 mm 的培養皿中流延成膜，在30～50 ℃烘箱中烘干6 h，揭膜，得到單一殼聚糖膜。單一巰基化殼聚糖膜的制備與單一殼聚糖膜制備方法相同。巰基化殼聚糖復合膜的制備，將結冷膠置于100 mL 去離子水中加熱溶解，再加入巰基化殼聚糖，攪拌，完全溶解后，再加入甘油、氯化鈣和納他霉素，攪拌均勻，得到混合溶液，超聲脫氣，復合膜液流延成膜，在30～50 ℃烘干6 h，揭膜，得到復合膜。

1.2.4 膜性能的測定 膜厚度的測定參考GB/T 6672-2001《塑料薄膜與薄片厚度的測定機械測量法》；膜透光率的測定參考文獻[27]；膜水蒸汽透過率的測定參考文獻[28]；膜機械性能（拉伸強度和斷裂伸長率）的測定參考GB/T 1040.1-2018 塑料 拉伸性能的測定的方法，用溫控式電子萬能材料試驗機測定。

1.2.5 單因素實驗 以結冷膠、甘油、氯化鈣和納他霉素的添加量為單因素。固定基礎膜液為添加0.2 g巰基化殼聚糖膜液，研究不同添加量的結冷膠（0、0.05、0.10、0.15、0.20 g）、甘油（0、0.25、0.50、0.75、1.00 g）、氯化鈣（0、0.3、0.6、0.9、1.2 g）、納他霉素（0、0.01、0.05、0.10、0.15 g）對巰基化殼聚糖復合膜綜合性能的影響。添加每種因素時，其他因素固定值如結冷膠為0.10 g，甘油為0.50 g，氯化鈣為0.60 g，納他霉素為0.05 g；單因素實驗得出最佳添加量后，以最佳添加量進行添加。

1.2.6 響應面試驗的設計

1.2.6.1 PB 試驗設計 以拉伸強度為響應值，確定結冷膠、甘油、氯化鈣和納他霉素這四個因素對巰基化殼聚糖薄膜綜合性能影響的重要性，進行試驗。實驗因素及水平設計見表1。

表1 Plackett-Burman 實驗因素水平及編碼Table 1 Factors level and coding of Plackett-Burman test

1.2.6.2 最陡爬坡實驗設計 根據PB 試驗及其實驗結果，對顯著因素效應值進行梯度設計，根據顯著因素一次項的系數，正系數逐漸遞增確定變化范圍；負系數逐漸遞減確定變化范圍；能夠快速經濟的逼近最佳添加量區域，根據最陡爬坡實驗結果確定響應面優化試驗的中心點[29]。

1.2.6.3 響應面分析試驗設計 根據最陡爬坡試驗結果，以拉伸強度（Y）為響應值，利用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面旋轉中性組合試驗設計，每個因素選取三個水平，根據Design Expert 實驗表進行實驗，對實驗數據進行二次回歸擬合，分析選取因素的主效應和交互作用，然后分析確定結冷膠、甘油、氯化鈣和納他霉素的最佳添加量，實驗因素及水平設計如表2 所示。

表2 響應面實驗因素及水平設計Table 2 Response surface factors and levels

1.3 數據處理

采用SPSS Statistic17.0 對數據進行顯著性分析；采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面試驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 巰基化殼聚糖的巰基含量

通過Ellman’s 試劑法得到標準曲線方程為A=2.5501C+0.0539（A 為吸光度，C 為巰基濃度μmol/mL）；決定系數R2=0.9984。通過標準曲線計算得到，巰基化殼聚糖中巰基含量為156.11 μmol/g，表明殼聚糖經過巰基化改性成功接入了巰基基團。巰基化殼聚糖可直接溶于水，與結冷膠混合，可進行下一步研究。

2.2 單一膜力學性能的測定

單一殼聚糖膜拉伸強度為0.928 MPa，但斷裂伸長率僅為5.91%；單一巰基化殼聚糖膜拉伸強度為0.350 MPa，斷裂伸長率為14.47%。由結果可知，單一的殼聚糖膜及巰基化殼聚糖膜的力學性能相對較差，需要進一步改性以提高其力學性能。

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 結冷膠添加量對復合膜性能的影響 由表3可知，隨著結冷膠含量的增大，拉伸強度不斷增加，然而當結冷膠添加量為0.20 g 時，拉伸強度下降，推測可能因結冷膠添加過多，膜液過于粘稠，不易流延成膜，導致膜的厚度不均勻，拉伸強度不佳，這與李夢琦等[30]研究結果類似；其斷裂伸長率稍有降低，差異不明顯；水蒸汽透過率逐漸降低，這可能是由于結冷膠與其他復合物之間形成了致密的結構，膜的自由體積減少，水分擴散困難，從而使膜阻水性增強。由表3可看出結冷膠添加量為0.15 g 時，復合膜的機械性能整體較好。因此，結冷膠的添加量以0.15 g 為最佳。

表3 結冷膠添加量對膜性能的影響Table 3 Effect of gellan addition amount on film performance

2.3.2 甘油添加量對復合膜性能的影響 由表4 可知，隨著甘油添加量的增加，膜的力學性能增強，因為甘油作為一種含有多羥基親水基團的小分子，具有較強的親水性，其分子內部的羥基與殼聚糖分子中的羥基結合形成鏈間氫鍵，從而減少殼聚糖分子內部間的作用力，改善柔化了巰基化殼聚糖的剛性結構，使膜更加柔軟，增加其柔韌性，所以斷裂伸長率逐漸增大，而復合膜的拉伸強度先增大后逐漸減小[31]。隨著甘油濃度的增加，膜的溶脹度降低，水蒸汽透過率逐漸增加，這可能是因為甘油分子的加入，膜的結構變得松散且由于甘油分子在基質中不易揮發，增加了膜的極性從而增大膜的透水能力[32]。

表4 甘油添加量對膜性能的影響Table 4 Effect of glycerin addition amount on film performance

此外，隨著甘油濃度的增加，膜的透光率先增加后減小。因此，當甘油添加量高于0.5 g 時，膜開始變得十分軟黏，相應拉伸強度明顯減小，再綜合考慮膜的溶脹度和水蒸汽透過率，故選取甘油添加量為0.5 g 為宜。

2.3.3 氯化鈣添加量對復合膜性能的影響 由表5可知，隨著氯化鈣濃度的增加，膜的拉伸強度以及斷裂伸長率均先增加后減小；當氯化鈣添加量增加到0.3 g時有最大值，這可能是因為氯化鈣作為交聯劑，使復合膜中的大分子連接更為緊密，分子鏈間的交聯密度增大從而使其機械強度提高[33]。但氯化鈣超過一定濃度，使得交聯濃度過大，反而減小膜的延展性，變得硬脆，同時鈣離子游離于膜中，拉伸強度降低。

表5 氯化鈣添加量對膜性能的影響Table 5 Effect of calcium chloride addition amount on film performance

隨著氯化鈣濃度的增加，復合膜的水蒸汽透過率逐漸降低；膜的透光率隨著氯化鈣濃度增加而減小，因為隨著氯化鈣濃度的增加，厚度逐漸增大，使得透光率逐漸減小；氯化鈣交聯使得膜的親水性降低，并形成不溶于水的凝膠，氯化鈣作為交聯劑會提高透水性，從而降低阻濕性，不利于食品的貯藏保鮮。

綜上分析，氯化鈣作為交聯劑，可以明顯地改善膜的機械性能，但氯化鈣濃度過高，反而會降低膜的力學性能，綜合各性能分析，選取氯化鈣添加量為0.3 g 為宜。

2.3.4 納他霉素添加量對復合膜性能的影響 結果如表6 所示。

表6 納他霉素添加量對膜性能的影響Table 6 Effect of natamycin addition amount on film performance

由表6 可知，納他霉素的添加對于膜的機械性能無顯著影響，拉伸強度和斷裂伸長率隨著納他霉素濃度的增加呈先增加后降低的變化趨勢，但整體變化不顯著；膜的水蒸汽透過率與透光率有明顯的降低，這可能是因為納他霉素添加量的增加使得薄膜的結構更加致密所致。當納他霉素添加量達到0.01 g時，膜的拉伸強度、斷裂伸長率及透光率最佳。因此，選取納他霉素的添加量為0.01 g 為宜。

2.4 響應面試驗結果

2.4.1 Plackett-Burman 試驗結果 在單因素實驗的基礎上，設計PB 試驗，PB 試驗設計及結果見表7，方差分析見表8。從方差分析表中可看出，此回歸模型的主效應P值為0.0331 小于0.05，表明模型顯著，擬合性良好，表明PB 試驗設計因素在所選取的水平范圍內對拉伸強度的作用顯著，同時決定系數為0.9965，調整決定系數為0.9810，說明回歸模型設計可靠。另外，由表8 可知，對拉伸強度有顯著作用的因素有結冷膠、甘油以及氯化鈣，結冷膠和甘油對拉伸強度的影響呈現正效應，而氯化鈣和納他霉素則為負效應，而納他霉素對拉伸強度的影響不顯著。

表7 Plackett-Burman 實驗設計結果Table 7 Plackett-Burman design of experiment results

表8 PB 實驗方差分析Table 8 Efficiency evaluation of Plackett-Burman experiment

2.4.2 最陡爬坡試驗結果 根據Plackett-Burman 試驗結果，最陡爬坡試驗設計與結果如表9 所示。隨著結冷膠、甘油和氯化鈣添加量的變化，膜的拉伸強度呈現增大后減小的趨勢。結冷膠添加量為0.175 g、甘油添加量為1.000 g、氯化鈣添加量為0.200 g 時，拉伸強度達到最大值，說明此時比較接近最佳響應區。因此以結冷膠添加量為0.175 g、甘油添加量為1.000 g、氯化鈣添加量為0.200 g 作為試驗的中心點，設計響應面試驗。

表9 最陡爬坡實驗設計與結果Table 9 Design and results of the steepest ascent experiment

2.4.3 響應面試驗結果與分析 響應面試驗設計方案及結果見表10、表11。利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表11 試驗數據進行回歸分析，得到回歸模型：拉伸強度=-54.43775+434.84A+41.18125B+12.5725C+54.5AB+71AC-5.75BC+1418.4A2-25.475B2-58.4C2。

表10 Box-Behnken 設計方案及結果Table 10 Design and results of Box-Behnken experiments

表11 回歸方程方差分析Table 11 Variance analysis of regression equation

從表11 可看出，本試驗的模型極顯著（P＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.3275＞0.05），說明該回歸模型能夠很好的擬合試驗結果。該模型的校正決定系數R2Adj=0.9597，R2=0.9824，說明該模型能夠解釋95.97%的響應值變化，因而該模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型可以用于篩選出復合膜的最佳配比。由回歸模型可看出，A、B、C、AB、AC、A2對拉伸強度為正效應，BC、B2、C2對拉伸強度為負效應，其中B、C、A2、B2、C2對復合膜拉伸強度的影響是極顯著的（P＜0.01），A、AB、對復合膜拉伸強度的影響是顯著的（P＜0.05），AC、BC 對復合膜拉伸強度的影響是不顯著的（P＞0.05）；從交互系數可以看出結冷膠和氯化鈣添加量的交互作用＞結冷膠和甘油添加量的交互作用＞甘油和氯化鈣添加量的交互作用。

2.4.4 各因素之間的交互作用 從響應面可以直觀的看出，圖1 曲面陡峭，同時等高線為橢圓形，說明結冷膠和甘油添加量的交互作用對響應值的影響顯著（P＜0.05）；圖2 等高線稀疏近圓形，說明結冷膠和氯化鈣添加量的交互作用對響應值的影響并不顯著（P=0.0909＞0.05）；由圖3 可知，甘油和氯化鈣的添加量對響應值影響的響應面圖等高線近圓形，說明甘油和氯化鈣添加量的交互作用對響應值的影響不顯著（P=0.4302＞0.05）。

圖1 結冷膠與甘油交互作用對復合膜拉伸強度影響的響應面和等高線Fig.1 Response surface plot and contour line of interaction between gellan gum and glycerin on tensile strength of composite film

圖2 結冷膠和氯化鈣交互作用對復合膜拉伸強度影響的響應面和等高線Fig.2 Response surface plot and contour line of interaction between gellan gum and calcium chloride on tensile strength of composite film

圖3 甘油和氯化鈣交互作用對復合膜拉伸強度影響的響應面和等高線Fig.3 Response surface plot and contour line of interaction between glycerin and calcium chloride on tensile strength of composite film

隨著結冷膠、甘油以及氯化鈣添加量的增加，復合膜拉伸強度都是先增加后減小。結冷膠和巰基化殼聚糖都屬于多糖類化合物，混合后相容性較好，分子間氫鍵更加緊密的結合，使得膜的綜合性能發生變化。隨著結冷膠含量的增加，溶質不容易充分溶解，從而影響結冷膠和巰基化殼聚糖分子間氫鍵的形成，作用力有所下降，影響復合膜的致密性，使得復合膜拉伸強度下降。甘油是一種增塑劑，能夠進入高聚物分子鏈間，破壞高聚物分子間的相互作用，增加分子鏈的流動性，提高膜的延展性[34]，但是過量的甘油會減小巰基化殼聚糖與結冷膠分子間的作用力，導致復合膜的力學性能下降，所以甘油的添加了應控制在一定的范圍內，以確保成膜具有較好的機械性能。氯化鈣作為交聯劑，能夠使分子間形成致密的網狀結構，使復合膜中的大分子連接更為緊密，分子鏈間的交聯密度增大從而使得復合膜的機械強度提高，但當氯化鈣超過一定量，交聯濃度過大，反而減小膜的延展性，復合膜變的硬脆，同時鈣離子游離于膜中，使得拉伸強度降低。因此，結冷膠、甘油以及氯化鈣的添加量都應控制在一定范圍，復合膜的拉伸強度才能達到最大值。

通過響應面模型得到復合膜的最佳配比為結冷膠添加量為0.18 g，甘油添加量為0.98 g，氯化鈣添加量為0.17 g，預測復合膜拉伸強度為5.066 MPa。

進一步驗證響應面分析方法的可靠性，同時為了方便實際操作將最優配比調整為結冷膠添加量為0.18 g，甘油添加量為1.00 g，氯化鈣添加量為0.17 g，在此最佳配比條件下，進行3 次驗證性試驗，測得復合膜拉伸強度的平均值為4.986±0.087 MPa，與預測值5.066 MPa 基本一致。因此，通過Box-Behnken試驗得到的最佳配方配比較可靠，具有實際應用價值。

3 結論

以巰基化殼聚糖為成膜基質，再復配結冷膠改善其性能，以甘油為增塑劑，氯化鈣為交聯劑，納他霉素為抑菌劑，制備出綜合性能良好的改性殼聚糖復合膜。通過單因素實驗與Plackett-Burman 試驗，對復合膜性能的影響大小為：氯化鈣＞結冷膠＞甘油＞納他霉素；通過最陡爬坡試驗與Box-Behnken 響應面試驗，建立復合膜拉伸強度相對與結冷膠添加量、甘油添加量以及氯化鈣添加量的二次多元回歸方程，確定最優配比：結冷膠添加量為0.18 g，甘油添加量為1.00 g，氯化鈣添加量為0.17 g，納他霉素0.01 g。在此條件下，復合膜拉伸強度的預測值為5.066 MPa，進行3 次驗證性試驗，測得復合膜拉伸強度的平均值為4.986±0.087 MPa，表明該數據模型對復合膜拉伸強度有較好的預測能力。該試驗結果表明巰基化殼聚糖復配結冷膠、甘油、氯化鈣以及納他霉素，能夠增強復合膜的機械性能，預期能廣泛應用于食品保鮮領域。