香菇酶法制備調味品基料的工藝優(yōu)化

張婷婷，丁婼微，張賓樂

（1.武夷學院茶與食品學院，福建南平 354300；2.福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建廈門 361012；3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

香菇在民間素有“山珍”之稱，具有豐富的營養(yǎng)，味道鮮美，享有“植物皇后”美譽。其子實體含有豐富的天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸及一般食品中罕見的傘菌氨酸、口蘑酸及鵝氨酸等呈味氨基酸，還富含鳥苷酸、腺苷酸、胞苷酸、尿苷酸等呈味核苷酸。香菇中的5'-核苷酸對咸、酸、苦、腥味等具有消殺作用，其中5'-鳥苷酸添加到鮮味劑氨基酸類物質中可使鮮度提高幾十倍至上百倍，是著名的強力助鮮劑。香菇中含有的葡萄糖、果糖、半乳糖等碳水化合物、不飽和脂肪酸、VB1、VB2、VPP及Fe、Ca 等微量元素，與呈鮮味物質相互作用，形成香菇獨特的鮮美滋味。此外，還含有多糖、香菇腺嘌呤、維生素D 等生物活性物質，賦予了香菇的藥用價值[1-5]。

食用菌具有味道鮮美、提高免疫力與保健功效等多種特點，在復合調味品中的應用也越來越廣泛[6]。香菇調味品的出現(xiàn)，彌補了我國調味料領域在動植物蛋白水解物和復合調味料研究中的一個空缺[7]。將香菇經過酶解，使組織結構破壞，香菇中的風味物質和營養(yǎng)成分溶出，再經適當加工處理，可制成香菇調味品基料[8-11]。目前提取香菇的方法包括熱水浸提、酶解提取、自溶提取、微波提取、超聲提取等，其中應用最廣泛的是酶解法。相比于單一酶法提取，復合酶法具有提取率高，時間短的優(yōu)點[12]。本研究以香菇為原料，氨基酸態(tài)氮含量及感官評分為考察指標，首先采用纖維素酶降，使香菇細胞壁破碎，有利于胞內蛋白質等大分子的溶出；再利用復合蛋白酶降解，增加小分子肽和游離氨基酸等呈味物質的溶出，提高香菇酶解液的風味和營養(yǎng)價值[13]。以提高香菇附加值、豐富調味品市場及提高調味料的天然、營養(yǎng)及安全性為目的，為香菇系列調味品的研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

鮮香菇 雙好超市；纖維素酶（酶活力5 萬U/g） 寧夏和氏璧生物技術有限公司；風味蛋白酶（酶活力10 萬U/g）浙江一諾生物科技有限公司；菠蘿蛋白酶（酶活力5 萬U/g）南寧龐博生物工程有限公司。氫氧化鈉 國藥集團化學實劑有限公司；乙酸鋅、亞鐵氯化鉀 上海展云化工有限公司；濃硫酸、濃鹽酸 三圓化學實劑有限公司；甲醛、酒石酸鈉、亞硫酸鈉、3,5-二硝基水楊酸 上海國藥實劑集團。

JYL-C022E 榨汁機 九陽股份有限公司；YL-100 實驗室超純水機 深圳市億利源水處理設備有限公司；BAS124S 電子天平 鶴壁市天冠儀器儀表有限公司；HH-4 恒溫水浴鍋 邦西儀器科技（上海）有限公司；C21-Simple103 電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司；TG-16G 高速離心機 億發(fā)科技有限公司；UV752 分光光度儀 天泰實驗儀器有限公司；CJJ78-1 磁力攪拌器 金壇市大地自動化儀器廠；PHS-25 酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 將香菇制成調味品基料的工藝流程如下：

新鮮香菇→預處理→纖維素酶酶解→滅酶→測定還原糖含量→復合蛋白酶酶解→滅酶→冷凍離心→取上清液→測定氨基態(tài)氮含量、成品檢驗

1.2.2 操作要點 將新鮮香菇除梗、洗凈、置于榨汁機中，加入蒸餾水并打漿，制成香菇與水的質量比為14%的香菇勻漿；選擇適宜的pH、溫度、時間及加酶量進行水解；置于沸水浴中滅酶15 min；在7000 r/min、4 ℃條件下，冷凍離心15 min。

1.2.3 纖維素酶添加量的確定 該廠家提供的纖維素酶，最適酶解溫度為50 ℃，pH 為4.8。因此，取30 mL 香菇勻漿，在最適條件下，分別添加0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%和2.0%的纖維素酶水解3 h，在100 ℃水浴中滅酶15 min，再冷凍離心后取上清液，測定還原糖含量，平行測定三組。

1.2.4 復合蛋白酶酶解的單因素實驗設計 取40 mL纖維素酶降解后的香菇液進行復合蛋白酶酶解實驗。資料表明[14]風味蛋白酶與菠蘿蛋白酶復合酶解的香菇液風味最好，水解程度較高；同時，預實驗得出復合蛋白酶的不同復配比例對酶解效果影響不大，故選取風味蛋白酶與菠蘿蛋白酶以酶活比1:1 復配進行實驗。

固定總加酶量0.4%，pH 為6.5，酶解時間3 h，溫度分別設為40、45、50、55 和60 ℃，考察酶解溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響；固定酶解溫度50 ℃，酶解時間3 h，總加酶量0.4%，pH 分別設為6、6.5、7、7.5 和8，考察pH 對氨基酸態(tài)氮含量的影響；固定酶解溫度50 ℃，pH 為6.5，總加酶量0.4%，分別酶解0.5、1、1.5、2、2.5 和3 h，考察酶解時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響；固定酶解溫度50 ℃，酶解時間3 h，pH 為6.5，總加酶量分別設為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%，考察總加酶量對氨基酸態(tài)氮含量的影響。

1.2.5 復合酶酶解的響應面實驗設計 根據單因素實驗結果，采用DesignExpert 10 設計三因素三水平響應面優(yōu)化實驗，以pH、酶解溫度、總加酶量為因子，氨基酸態(tài)氮含量為響應值，設計響應面因素水平實驗方案，如表1 所示。平行測定三組實驗，得出復合酶解的最適工藝參數(shù)。

表1 響應面因素水平設計Table 1 Response surface factor level design

1.2.6 指標測定方法

1.2.6.1 還原糖的測定 采用DNS 比色法[15]。

1.2.6.2 氨基酸態(tài)氮的測定 參照GB 5009.235-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的第一法[16]。

1.2.6.3 感官評定 取最優(yōu)工藝參數(shù)下制備的香菇調味基料40 mL，置于透明的塑料杯中。挑選10 名食品專業(yè)的教師，組建感官評定小組，根據表2 感官評定標準進行感官評定，總分百分制。

表2 香菇調味基料的感官評定標準Table 2 Sensory evaluation criteria for Lentinus edodes flavoring substrates

1.2.6.4 谷氨酸鈉的測定 對酶解前的香菇勻漿及酶解后的香菇調味基料中的谷氨酸鈉含量，參照SB/T10371-2003《中華人民共和國商業(yè)行業(yè)標準雞精調味料》中的甲醛值法[17]進行對比測定。

1.2.6.5 呈味核苷酸二鈉的測定 對酶解前的香菇勻漿及酶解后的香菇調味基料，參照SB/T10371-2003 中的5.2.4 部分[17]進行呈味核苷酸二鈉含量的對比測定。

1.3 數(shù)據處理

每組實驗均平行測定3 次，采用SPASS 18 對實驗所得數(shù)據進行顯著性差異分析，響應面優(yōu)化采用Design-Expert 10 軟件進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶添加量的確定

2.1.1 葡萄糖標準曲線 設540 nm 處測得的吸光值為縱坐標，葡萄糖標樣的毫克數(shù)為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，如圖1 所示，其決定系數(shù)R2為0.9993，線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucosestandard curve

2.1.2 纖維素酶添加量的確定 由于香菇的子實體本身的酶活力較低，難以有效作用使菌絲體自溶。因而在抽提細胞內水溶性呈味物質時，必須外加相應的酶類。纖維素酶可將纖維素部分降解為葡萄糖并有破壞菇體細胞壁的作用，可促進細胞內蛋白質、核酸、多糖等物質的溶出。因此。外加纖維素酶可明顯提高香菇固形溶出率和蛋白溶出率，對蛋白水解也有一定的促進作用[4,18]。

如圖2 所示，隨著纖維素酶添加量的增加，還原糖含量逐漸上升。添加量在0.2%～1%時，還原糖含量上升較為緩慢；在1%～1.4%時，還原糖含量迅速上升；添加量大于1.4%，還原糖含量雖有上升，但上升速率減緩。這是由于纖維素酶濃度超過底物濃度時，再添加酶對酶解反應影響不大。因此綜合成本因素考慮，纖維素酶添加量確定在1.4%為宜。

圖2 加酶量對還原糖含量的影響Fig.2 Effect of adding enzyme amount on reducing sugar content

2.2 復合酶解條件的確定

復合蛋白酶可將菌體蛋白和溶出的胞內蛋白質分解為一些水溶性的小分子含氮物質，提高固形物溶出率和呈鮮味氨基酸的含量[4]。不同因素條件對香菇液酶解效果的影響如下。

2.2.1 酶解溫度的確定 由圖3 可知，隨著溫度的上升，氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢(P＜0.05)，在50 ℃時最高，這是由于酶在最適溫度范圍內，能表現(xiàn)出最高的酶活性。在50 ℃之后，氨基酸態(tài)氮的含量開始下降，這是由于溫度過高會導致酶的變性失活。因此，在響應面試驗中酶解溫度設定在50 ℃左右。

圖3 酶解溫度對氨基態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on amino nitrogen content

2.2.2 酶解pH 的確定 由圖4 可知，pH 對氨基酸態(tài)氮含量的影響較為顯著（P＜0.05）。隨著pH 的增大，氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢，在pH 為6.5 時達到最高。由于不同的酶在各自的最適pH 范圍內，能達到最高的酶活力，水解效果最好。因此，響應面實驗中復合酶解的pH 設定在6.5 左右。

圖4 酶解pH 對氨基態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of pH value of enzymatic hydrolysis on amino nitrogen content

2.2.3 酶解時間的確定 由圖5 可知，隨著時間的延長，氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升。在2.5 h 前，上升速率較大（P＜0.05），2.5 h 之后趨于平緩（P＞0.05），說明酶解反應已接近結束。因此，從成本因素考慮，酶解時間可直接確定在2.5 h。

圖5 酶解時間對氨基態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on amino nitrogen content

2.2.4 總加酶量的確定 由圖6 可知，隨著加酶量的增大，氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升。在加酶量0.4%前，上升速率較為顯著（P＜0.05）；在0.4%后，上升趨于平緩（P＞0.05），說明加酶量已飽和或超過底物量，再過多添加酶對酶解反應并無促進作用。因此，在響應面試驗中總加酶量設定在0.4%左右。

圖6 總加酶量對氨基態(tài)氮含量的影響Fig.6 Effect of total amount of enzyme added on amino nitrogen content

2.3 響應面優(yōu)化

2.3.1 響應面試驗結果 實驗結果如表3 所示。通過對實驗數(shù)據進行分析，得到了pH (A)、酶解溫度（B）、總加酶量（C）的二次多元回歸方程：Y=0.061+3.375×10-3A-0.014B-3.000×10-3C-3.250×10-3AB-6.500×10-3AC+3.000×10-3BC-0.010A2-3.575×10-3B2-0.017C2。

表3 響應面試驗方案與結果Table 3 Response surface experiment scheme and results

由表4 方差分析可知，得到該模型中的F值為91.43，且P值小于0.01，而失擬項不顯著P=0.7714＞0.05，表明模型顯著，二次模型選擇合適。該模型R2=0.9916，表明該模型擬合度良好，實驗誤差小，適合對香菇酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量進行分析和預測。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

各單項因素A、B、C 影響氨基酸態(tài)氮含量均為極顯著（P＜0.01）；pH(A)和酶解溫度（B）的交叉項以及酶解溫度（B）和總加酶量（C）的交叉項對氨基酸態(tài)氮含量的影響具有顯著性（P＜0.05），pH（A）和總加酶量（C）的交叉項對氨基酸態(tài)氮含量的影響極顯著（P＜0.01）。說明氨基酸態(tài)氮含量對該模型具有高度顯著性。因此，該模型的回歸方程可代替實驗的真實值來預測和分析結果。根據回歸分析的結果與回歸方程做出因素影響的響應面和等高圖如圖7、圖8和圖9 所示。

圖7 酶解溫度與pH 對氨基態(tài)氮含量的影響的響應面和等高圖Fig.7 Response surface and contour map of the effects of enzymatic hydrolysis temperature and pH on amino nitrogen content

圖8 酶解溫度與總加酶量對氨基態(tài)氮含量的影響的響應面和等高圖Fig.8 Response surface and contour map of the effects of enzymatic hydrolysis temperature and total amount of enzyme added on amino nitrogen content

圖9 酶解pH 與總加酶量對氨基態(tài)氮含量的影響的響應面和等高圖Fig.9 Response surface and contour map of the effects of enzymatic pH and total amount of enzyme added on amino nitrogen content

2.3.2 驗證實驗 通過實驗和響應面模型擬合方程得出的最佳工藝參數(shù)如下：pH 為6.8，溫度48.7 ℃，總加酶量0.28%，氨基酸態(tài)氮含量的預測值為0.61 mg/mL。以該工藝參數(shù)進行三組平行實驗，取平均值，氨基酸態(tài)氮含量實測值為0.63±0.01 mg/mL，與模型的預測值0.61 mg/mL 相對誤差僅為3.28%，證明了實驗模型預測結果的可靠性。

2.4 成品檢驗

2.4.1 感官評定 以最優(yōu)工藝參數(shù)制得的香菇調味基料成品，色澤呈棕褐色、明亮無沉淀物，味感醇厚鮮美，有香菇特有的風味，微苦。感官評定總分為95 分。

2.4.2 酶解前后谷氨酸鈉含量的變化 香菇的主要呈鮮味物質為5’-核苷酸和呈鮮味氨基酸[19]。由圖10可知，經酶解后的香菇液，其谷氨酸鈉的含量從酶解前的0.306%升高至酶解后的0.765%，提高了約1.5 倍。谷氨酸鈉作為香菇的主要呈鮮物質之一，為酶解后的香菇液提供了香菇的特有風味，酶解后鮮味顯著提升。

圖10 酶解前后谷氨酸鈉含量的變化Fig.10 Change in the content of monosodium glutamatebefore and after enzymatic hydrolysis

2.4.3 復合酶酶解前后的呈味核苷酸二鈉含量對比

呈味核苷酸二鈉主要在香菇菌體細胞內存在，酶解尤其是纖維素酶破壞了香菇的細胞壁，使胞內呈味核苷酸二鈉更易溶出[14]。

由圖11 可知，香菇液被酶解后，呈味核苷酸二鈉含量從酶解前的0.45%提高至酶解后的0.53%，提高了17.78%。

圖11 酶解前后呈味核苷酸二鈉含量的變化Fig.11 Changes in the content of taste nucleotide disodium before and after enzymatic hydrolysis

3 結論與展望

本課題以新鮮香菇為原料，采用復合酶法制備食品調味基料。將新鮮香菇勻漿先采用1.4%纖維素酶水解，再采用復合蛋白酶（風味蛋白酶:菠蘿蛋白酶=1:1）在48.7 ℃，pH6.8，總加酶量0.28%條件下水解2.5 h，制備的香菇調味基料中氨基態(tài)氮含量為0.63±0.01 mg/mL。與酶解前相比，谷氨酸鈉含量提高了約1.5 倍，呈味核苷酸二鈉含量提高了17.78%。制得的香菇調味基料呈棕褐色、質地均一穩(wěn)定，滋味醇厚鮮美，有香菇特有風味，微苦，感官評分較高。

本課題采用先纖維素酶降解、后菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶復合提取的方式，在最適宜條件下，使香菇提取液中的氨基酸態(tài)氮含量達到最高，其它小分子營養(yǎng)成分、功能性成分及風味物質被充分抽提，獲得的香菇調味基料感官評分最高。與于洋[20]的研究結果相比較，得到的酶解液中氨基態(tài)氮含量接近，但降低了總加酶量、酶解時間及酶解溫度，因此明顯降低了成本。為促進香菇的提取利用及香菇系列天然營養(yǎng)鮮味劑的開發(fā)，提供了理論依據和實際應用價值。

目前在整個調味品市場當中，復合調味品占據的市場份額為80%以上，但是我國的只有20%左右，可以說有非常大的發(fā)展前景，調味品市場今后最具發(fā)展?jié)摿Φ氖翘烊粡秃险{味料[21-22]。食用菌類調味料已逐漸被消費者喜愛接受，采用酶解香菇法制備調味品具有廣闊的市場空間，有待繼續(xù)深入研究開發(fā)。該提取液可進一步脫水成粉末成品，利于貯藏；亦可調配其它鮮味原料，開發(fā)出不同風味系列的天然復合調味品，如復合食用菌調味汁、鮰魚香菇調味醬等[1,23-25]。