石墨烯/四氧化三鈷電化學傳感器的建立及餅干中香蘭素檢測分析

司曉晶，韓婧婷，朱文菁，黃 玥，白 晨，馬穎清

（1.上海商學院食品系，上海 200235；2.上海市農產品質量安全中心，上海 201708）

香蘭素，作為一種食品工業中常用的增香劑，已滲透進我們的日常飲食中，常用作巧克力、冰激凌、糖果、餅干、蛋糕、面包等的添加劑[1]。香蘭素氣味濃郁，新生兒若長期攝入可能對其形成依賴性，并養成挑食的習慣，同時還可能對其腸胃有一定的副作用，影響正常的生長發育，過量食用會造成頭暈惡心、嘔吐腹瀉等癥狀，甚至影響人體腎臟和肝臟的工作[2]。各個國家都對香蘭素的添加量嚴格管控，我國在GB 2760-2014 食品用香料使用中規定，香蘭素嚴禁加入6 個月以內嬰幼兒奶粉及一些殺菌乳等奶制品中，然而目前尚未制定標準檢測方法[3]，所以建立快速有效簡便的香蘭素檢測方法尤為必要。

目前主要的香蘭素檢測方法有紫外分光光度法[4-5]、熒光分光光度法[6]、拉曼光譜法[7]、毛細管電泳法[8]和高效液相色譜法[9-11]及色譜-質譜聯用方法等[12-14]。但這些方法存在前處理過程繁瑣、設備儀器昂貴或靈敏度、準確性不高等問題。然而，近年來電化學分析方法的快速發展及其表現出的檢測優勢，促使人們越發傾向于采用此法對香蘭素進行檢測[15-19]。

石墨烯（graphene，GR），因其具有大的比表面積、良好的機械性能和電子傳遞效率，在電化學傳感器方面，有較好應用基礎和前景[20-22]。Co、Ni、Au、Cu 等都是當今研究較深入的應用于電催化的金屬，這些金屬元素在電化學反應中具有較高催化能力、較大表面積和較高熱穩定性，因而在電化學領域中極具潛力[23-25]。所以，本文先將GR 滴涂到裸的玻碳電極（glass carbon electrode，GCE）表面，再在Co（COOH）2溶液中通過循環伏安法（Curve of cyclic voltammetry，CV）電聚合，得到Co3O4/GR/GCE 修飾電極，作為香蘭素檢測的電化學傳感器，由于該傳感器測得的電信號與香蘭素的濃度呈一定相關性，因此可實現香蘭素定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GR（單層，片徑0.5～5 μm，厚度約0.8 nm，物理法制得）南京先豐納米材料科技有限公司；甘氨酸、丙氨酸、精氨酸等氨基酸 探索平臺；香蘭素、無水乙醇、濃硫酸、乙酸鈷等試劑 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；超純水 為實驗用水；0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS）為支持電解質溶液；袋裝原味夾心餅干 超市。

CHI 660D、842B 電化學工作站 上海辰華儀器有限公司；S-4800 掃描電鏡 日本HITACHI 公司；KQ 218 型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；FA2204B 分析天平 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 電化學傳感器的制備 GCE 預處理：將GCE作為工作電極，在麂皮板上用0.05 μm 的Al2O3粉末打磨拋光，依次用無水乙醇、超純水超聲清洗5 min，0.5 mol/L H2SO4溶液中-1～1 V 電位窗下CV 法活化10 圈，超純水沖洗干凈。

稱取2 mg 的GR 分散在2 mL 的超純水中，100 W，40 kHz 下超聲2 h 分散均勻得到濃度為1 mg/mL的GR 分散液。滴涂在預處理后的GCE 上，紅外干燥燈下干燥40 min，得到GR/GCE 修飾電極。接著將GR/GCE 電極放入含有0.02 mol/L Co（COOH）2溶液中，-0.8～1.6 V 電位窗下，CV 法電聚合20 圈，即得到復合修飾電極Co3O4/GR/GCE。在這個步驟中，Co(COOH)2因發生電化學氧化反應生成Co3O4，金屬Co 納米粒子的聚合使該修飾電極的電化學性能得到很大的提高[26]。制備結束后，將修飾好的電極用超純水小心清洗，以便進一步使用。對得到的GR/GCE 和Co3O4/GR/GCE 修飾電極進行電子掃描電鏡（Scanning electron micrograph，SEM）表征。

同時，另取一支干凈的GCE 于0.02 mol/L Co(COOH)2溶液中，-0.8～1.6 V 電位窗下，CV 法聚合20 圈得到Co3O4/GCE 修飾電極，超純水清洗后備用。

1.2.2 實驗樣品的預處理 稱取5 g 餅干充分研磨成粉末，溶解于10 mL 去離子水中，100 W，40 kHz下10 min 使充分溶解，然后將懸浮液放在離心機中以3000 r/min 的轉速離心2 次，取上清液備用。

1.2.3 測定方法 采用以飽和甘汞電極為參比電極、鉑電極為輔助電極、Co3O4/GR/GCE 修飾電極為工作電極的三電極系統，在0～1.0 V 電位范圍內，研究掃描速度不斷增加下香蘭素響應電信號變化情況以確定香蘭素在Co3O4/GR/GCE 修飾電極上的響應機理，用差分脈沖伏安法（Differential Pulse Voltammetry，DPV）測定不同PBS 緩沖溶液的pH 對香蘭素電信號影響情況，在最優的pH 條件下研究GR 滴涂量和Co(COOH)2聚合圈數的改變下香蘭素的電化學行為，建立香蘭素的最終實驗條件。在該最優實驗條件下DPV 檢測Co3O4/GR/GCE 修飾電極對不同濃度香蘭素的電信號，香蘭素濃度為橫坐標，電信號為縱坐標確定香蘭素線性范圍和檢出限及進行實際樣品中香蘭素含量測定。

1.3 數據處理

實驗重復3～5 次，數據處理使用軟件：OriginPro2015。

2 結果與分析

2.1 Co3O4/GR/GCE 修飾電極的形貌表征

對GR 和制備的Co3O4/GR 導電聚合物分別進行電子掃描電鏡（Scanning electron micrograph，SEM）表征，對比其相貌特征觀察GR 的褶皺形態及Co3O4是否已成功聚合在玻碳電極表面。圖1A 是修飾前的GR 在1 μm 下的SEM 圖，呈現出如絲綢般光滑的片狀形態，圖1B 展示了是Co（COOH）2電聚合到GR 后，形成的Co3O4/GR 納米復合物在1 μm下的微觀形貌，可以明顯觀察到Co3O4納米顆粒呈球狀均勻附著在GR 表面，同時也說明GR 是一種理想的納米材料，能夠固定吸附交聯住金屬納米粒子，GR 大的比表面積提供了Co3O4納米顆粒均勻結晶、附著和生長的良好環境。因此通過GR 修飾前后的SEM 圖，表明Co3O4和GR 已成功聚合。

圖1 GR(A)和Co3O4/GR(B)的掃描電鏡對比圖Fig.1 SEM of GR(A) Co3O4/GR(B)

2.2 香蘭素在Co3O4/GR/GCE 修飾電極上的電化學行為

為了比較幾種不同修飾電極對香蘭素的電化學行為，在本實驗中比較了裸 GCE（a）、Co3O4/GCE（b）、GR/GCE（c）和 Co3O4/GR/GCE（d）在20 μmol/L 香蘭素的0.1 mol/L pH=4.5 的PBS 溶液中響應值的大小，圖2 是各種修飾電極的DPV 圖，其電流響應值Ip分別是1.059、1.292、2.049、和3.150 μA。香蘭素在裸GCE 上雖有電流響應，但響應值Ip很小，分別以GR 和Co（COOH）2修飾后，Ip明顯增加，但當Co（COOH）2和GR 同時修飾到GCE 上時，香蘭素的氧化電流值最大，Ip為3.150 μA，幾乎具有累加的效果，而且是裸GCE 對香蘭素響應值（Ip=1.059 μA）的3 倍。這些數據說明，GR 和Co3O4的結合可以有效增大比表面積，提高電化學傳感器的電子傳導率和檢測樣品的靈敏度，Co3O4/GR/GCE 修飾電極作為香蘭素的電化學傳感器是可行的。

圖2 20 μmol/L 的香蘭素在不同電極上的DPV 圖Fig.2 DPVs of different elctrodes with 20 μmol/L vanillin

為了研究香蘭素在Co3O4/GR/GCE 修飾電極上的機理，在0.02～0.22 V/s 的掃描速率下使用CV 法對含有20 μmol/L 香蘭素的pH=4.5 的PBS 溶液進行測定（圖3），香蘭素的Ip隨著掃速增加而增大，且電位正向移動，這說明兩者的電化學氧化反應是不可逆的[26]。圖4 為在pH=4.5 PBS 溶液中Co3O4/GR/GCE 的掃速（ν1/2）和對20 μmol/L 香蘭素電流響應的關系圖。可以觀察到在0.02～0.22 V/s的速率范圍內，香蘭素的Ip與掃速ν1/2成正相關，線性方程表示為Ip（μA）=6.9759ν1/2+0.3574（R2=0.999），這表明該電極受擴散控制。

圖3 20 μmol/L 香蘭素在Co3O4/GR/GCE 上不同掃速(0.02～0.22 V/s)的CV 曲線圖Fig.3 CVs of the Co3O4/GR/GCE containing 20 μmol/L Vanillin with scan rate ranging from 0.02 to 0.22 V/s

圖4 Ip 與υ1/2 間的線性關系圖Fig.4 Plots of peak current vs.the square root of scan rate

2.3 對Co3O4/GR/GCE 傳感器參數的優化

2.3.1 緩沖液pH 的影響 支持電解質溶液為PBS緩沖溶液，其pH 在一定程度會影響修飾電極的性能。圖5A 為pH 從3.5 到5.5 變化時，Co3O4/GR/GCE對20 μmol/L 香蘭素Ip的響應情況。可以看到pH 從3.5 增大到4.5，Ip也隨之增大。但pH 若繼續增大，則Ip出現下降趨勢。即當pH=4.5 時，Ip達到最高峰，因此，設定實驗體系中PBS 緩沖溶液的pH為4.5。

2.3.2 GR 滴涂量的影響 通過改變滴涂GR 的修飾量來研究其對香蘭素氧化電流Ip的影響。圖5B是GR 的滴涂量從4.0 μL 增加到12.0 μL 對香蘭素Ip的影響。可以觀察到在4.0～8.0 μL 范圍內，隨著GR 的滴涂量增加，香蘭素的Ip也呈增加趨勢，滴涂量為8.0 μL 時，香蘭素的Ip達到最高。然后當GR 滴涂量繼續增加到10.0 μL 時，Ip陡然下降。因此，在最終實驗中選擇滴涂8 μL 的GR 作為理想滴涂量。

2.3.3 Co（COOH）2聚合圈數的影響 導電聚合物修飾電極膜的厚薄一定程度取決于金屬溶液的聚合圈數的多少，聚合圈數越多，耗時越長，膜也會變厚。圖5C 為電聚合0.02 mol/L Co（COOH）2溶液圈數由10 圈到30 圈變化時，對0.1 mol/L PBS（pH=4.5）中20 μmol/L 香蘭素的Ip的影響。由圖5C 中可以明顯發現，20 圈時Ip最大，但當聚合超過20 圈時，Ip開始下降，這是由于Co3O4修飾膜過厚阻礙了電極表面電子的傳遞，因此，在Co（COOH）2溶液中電聚合20 圈為最優條件。

圖5 Co3O4/GR/GCE 在含有20 μmol/L 香蘭素的條件優化圖Fig.5 Optimizations of Co3O4/GR/GCE to 20 μmol/L anillin

2.4 香蘭素校正曲線

本文在最佳條件下利用DPV 對香蘭素進行線性范圍和檢出限的測定。圖6A 顯示了在不斷攪拌條件下，Co3O4/GR/GCE 在0.1 mol/L PBS 溶液 (pH 4.5) 中連續加入不同濃度香蘭素所得的DPV 響應曲線，其香蘭素濃度范圍為0.1～80 μmol/L。由圖6B，可以清楚發現香蘭素的Ip隨著其濃度的增加而增加，Co3O4/GR/GCE 修飾電極在0.1～80 μmol/L 濃度范圍內表現出良好的線性響應，線性回歸方程：Ip（μmol/L）=0.1518C+0.5103（R2=0.997），檢出限為0.033 μmol/L（S/N=3）。

圖6 不同濃度的香蘭素在Co3O4/GR/GCE 上的電流響應（A）和香蘭素的校準曲線（B）Fig.6 DPVs of Co3O4/GR/GCE at different concentrations of vanillin(A) and vanillin calibration curve（B）

2.5 穩定性和干擾性實驗

同一支Co3O4/GR/GCE 修飾電極被用于在0.1 mol/L pH=4.5 PBS 連續平行測定20 μmol/L 香蘭素5 次來研究構建的電化學傳感器的重復性。把該修飾電極置于4 ℃冰箱中保存14 d 后，再在相同條件下，平行測定香蘭素5 次，其Ip減少了3.78%，前后測定的相對標準偏差RSD 均小于2%，其結果見表1。結果說明實驗結果表明Co3O4/GR/GCE 對香蘭素的檢測具有良好的穩定性。

表1 Co3O4/GR/GCE 對香蘭素檢測的穩定性Table 1 Reproducibility of vanillin on Co3O4/GR/GCE

為了評估Co3O4/GR/GCE 對高靈敏度檢測香蘭素的選擇性能，選擇了一些食品中常見的物質加入含有20 μmol/L 香蘭素的0.1 mol/L PBS（pH=4.5）溶液中進行檢測干擾程度分析。從表2 中可以清楚看出，2000 μmol/L 的NaCl、KCl，1000 μmol/L 的葡萄糖（glucose，Glu）、麥芽糖（sucrose，Suc），500 μmol/L濃度的甘氨酸（glycine，Gly）、丙氨酸（alanine，Ala）、精氨酸（arginine，Arg）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、亮氨酸（leucine，Leu）、賴氨酸（lysine，Lys）和檸檬酸（citric acid，CA）對香蘭素的檢測并沒有明顯干擾，在5%容限范圍以內，證明了構建的Co3O4/GR/GCE 電化學傳感器選擇性較好。

表2 干擾離子對Co3O4/GR/GCE 測定的香蘭素影響Table 2 Effect of interfering ions on vanillin measured by Co3O4/GR/GCE

2.6 實際樣品分析

準確吸取100 μL 樣液在優化條件下進行DPV測定，通過加標回收實驗計算回收率，其結果見表3。表中數據顯示樣品中的香蘭素在Co3O4/GR/GCE上發生明顯的電化學響應信號，三次實驗的平均回收率102.4%，標準偏差為1.47%，證明Co3O4/GR/GCE構建的電化學傳感器對于香蘭素檢測具有穩定且可靠的電催化性能。

表3 餅干中香蘭素的測定（n=3）Table 3 Determination results of vanillin in cookie product (n=3)

3 結論

石墨烯高的機械強度、快速高效的傳熱性能及超高電導率的優勢是大多材料不可比擬的，此外良好的生物兼容性使其能夠與很多材料進行復合，其與金屬納米顆粒兩者之間的相互協同作用極大地提升了導電性和催化性，促進了待測物和復合修飾電極表面在氧化還原過程中電子的傳遞和轉移。因此本工作制備的Co3O4/GR/GCE 修飾電極作為香蘭素的電化學傳感器，實現了對待測物香蘭素的快速響應，回收率和重現性結果都比較理想，并應用于實際樣品中香蘭素含量檢測，開拓了石墨烯導電聚合物在食品添加劑中的檢測范圍，為香蘭素的檢測方法的制訂提供了數據支撐。