SPME-GC-MS 結合ROAV 分析腐乳中的主體風味物質

樊 艷

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇南京 210023）

腐乳是我國的傳統豆制品之一，由微生物發酵制得，一直以來以其獨特的風味和醇厚的口感廣受消費者的喜愛。其釀造史至今已有1000 多年[1]，產地分布廣泛，種類繁多，按其色澤分有紅腐乳、白腐乳、青腐乳等。雖然各地釀制的豆腐乳品種多樣，但其釀造工藝流程基本無差別，主要由制霉胚、腌制、加調料、裝壇、密封、發酵等6 個步驟組成[1]，不過因其所用配料不同，故產品之間風味各異。

近年來，學者對腐乳的研究主要集中在菌種[2]、營養成分[3]和風味物質這幾個方面。腐乳發酵過程是一個復雜的生化過程[4-5]，Wei 等[6]的研究結果表明油腐乳的風味物質形成的主要途徑有分解代謝和外源遷移，在腐乳發酵期間蛋白質、脂肪等大分子物質在酶解作用下經微生物分解代謝轉化為風味物質，腐乳生產過程加入的辣椒、花椒和鹽等輔料中的化合物會在后發酵階段遷移至腐乳胚中，進一步參與發酵產生某些風味物質，大部分的揮發性物質具有獨特的香氣，這些物質共同賦予了腐乳獨特的風味和滋味。胡文康等[7]比較分析了3 種不同類型腐乳中揮發性成分，結果表明用頂空固相微萃取提取揮發性成分可鑒定出102 種物質，紅方腐乳含量較高的風味物質有11 種，白方和青方腐乳的特征風味物質之一分別是茴香腦和吲哚；王倫興等[8]利用SPME-GCMS 聯用技術分析了茶香腐乳和紅腐乳中的揮發性風味物質，共檢測出104 種化合物，茶香腐乳所檢出的風味成分數量比紅腐乳多6 種；蔣麗婷等[9]采HSSPME/GC-MS 分別對白腐乳的湯汁和腐乳塊進行測定，得到的結論是腐乳塊中揮發性成分的檢出量和檢出率均大于湯汁；Xiao 等[10]采用GC-O/AEDA 和ROAV 評價各風味物質對腐乳總體風味的貢獻程度，結果表明丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、正己酸乙酯、反-2,4-癸二烯醛和2,6-二甲基吡嗪為腐乳的特征風味物質。

風味是評價加工產品品質的重要指標之一[11]。在各種食品中鑒定出的所有揮發性化合物中僅有一小部分是食品總體風味的重要貢獻者，大部分沒有顯著影響，而這些對食品風味有關鍵作用的化合物被定義為該食品的主體風味物質或關鍵風味物質[12]。ROAV 法是確定食品主體風味物質的一種新方法[12]，目前用ROAV 法確定腐乳關鍵風味物質的研究還很少。鑒于傳統大豆發酵食品之一的腐乳，其家庭作坊式發酵工藝仍然有一定市場，本文選用2 種自制腐乳和2 種市購腐乳為原料，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）檢測揮發性物質，計算ROAV 值找到關鍵風味物質，分析比較兩者的異同點，探討家庭作坊制作的腐乳其風味組成和主要風味物質，旨在為研究腐乳的特征揮發性風味物質的機理和控制及優化腐乳的生產加工提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

用于自制腐乳的豆腐 本地某菜場，兩種腐乳的編號分別為M1、M2；毛霉菌菌粉 濟寧玉園生物科技有限公司；腐乳 本地某超市，為兩種不同品牌的紅方腐乳，編號分別為C1 和C2。

Avanti J-26 臺式離心機 美國Beckman Coulter公司；含SPME 裝置的多功能樣品處理平臺 德國Gerstel 公司；SPME 萃取頭（50/30um DVB/CAR/PDMS）美國Supelco 公司；7890A-5975C 氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腐乳樣品的制作 參考杭梅等[13]的制作方法，稍作修改，將豆腐切成4 cm×4 cm×1.5 cm 大小，上鍋蒸5 min 后放置涼透。稱取15 g 毛霉菌菌粉，加入500 mL 水，攪拌均勻，切好的豆腐塊間隔（約1 cm）擺放在蒸鍋上，將配好的菌懸液均勻噴灑至豆腐塊的各表面，鍋底加水，蓋好蓋子，在室溫20 ℃條件下，1 d開始長毛，發酵3 d 后的毛豆腐用于制作霉豆腐乳。稱取1 000 g 毛豆腐，風干去除水滴，蘸上40 g 的52度白酒，裹上50 g 鹽、15 g 辣椒粉和1.6 g 花椒粉[1]，入瓶，M1 樣品添加10 mL 食用油封面，M2 未用油封面，于陰涼處避光密封儲存一周即可食用。

1.2.2 風味物質的分離 SPME 設置：精確稱取3 g樣品加入20 mL 頂空瓶中，多功能樣品處理平臺保溫箱溫度是60 ℃，平衡時間10 min，萃取時間30 min，250 ℃下解析時間300 s，并設定每次進樣前老化萃取頭的程序，老化溫度260 ℃，老化時間30 min（初次老化時間120 min）[14]。

GC-MS 條件：參考崔曉紅等[15]的方法，選用DB-5 MS 毛細管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣He（純度≥99.999%）；載氣流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣；程序升溫：起始溫度35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min 升到80 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min 升到200 ℃，保持20 min。傳輸線溫度是280 ℃，離子源是EI，離子源溫度是230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量是70 eV，數據采集模式為全掃描（Scan），質量掃描范圍m/z 30～450 amu。

1.2.3 風味物質的鑒定 揮發性物質的定性和定量：氣質聯用得到質譜數據經與NIST08.L 標準譜庫檢索鑒定，將匹配度大于90 的作為定性依據之一，將計算得到保留指數（retention index，RI）值與其他文獻測定的RI 值進行對比確認，進一步對腐乳的揮發性成分進行定性[16]；采用峰面積歸一化法進行定量，計算得到各風味物質的相對含量。

RI 值的測定：取正構烷烴混合標準品（C7～C40），濃度為500 mg/L，稀釋100 倍，進樣量1 μL，分流比10:1，溶劑延遲時間5 min，其余參數同上。計算公式[17]為

式中，tx是待測組分的保留時間，min；tn是碳原子數為n 的正烷烴（tn＜tx）的保留時間，min；tn+1是碳原子為n+1 的正烷烴（tx＜tn+1）的保留時間，min。

主體風味物質的評價方法：主體風味物質采用ROAV 法評價各揮發性成分對樣品總體風味的貢獻，計算公式為

式中，C%x、Tx是各揮發性成分的相對百分含量和相對應的感覺閾值；C%stan、Tstan是對樣品總體風味貢獻最大的組分的相對百分含量和相對應的感覺閾值。

ROAV 值越大的成分對樣品總體風味的貢獻越大，1≤ROAV≤100 的成分為樣品的主體風味化合物，0.1≤ROAV＜1 的成分被認為是對樣品總體風味具有重要修飾作用的化合物[18]。

1.3 數據處理

本文采用Excel 2007、Origin pro 2018C 對數據進行處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 揮發性物質的分析

通過對4 種腐乳樣品揮發性物質采用SPMEGC-MS 聯用儀進行檢測，共測出74 種揮發性化合物，腐乳樣品的總離子流色譜圖（total ion current of chromatograms,TIC）如圖1 所示，本實驗所設置的參數能較好分離這些揮發性物質。

圖1 腐乳揮發性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion current of chromatograms of flavor substances in Sufu

通過GC-MS 檢測分析，對4 種腐乳樣品的揮發性物質進行分類統計（表1），結果表明4 種腐乳揮發性物質的種類和相對含量都有明顯差異，自制腐乳M1 和M2 中風味物質種類較市購腐乳C1 和C2 豐富。M1 共鑒定出36 種揮發性物質，相對含量最高的為烯烴類物質，其中萜烯類物質3-蒈烯占了43.81%；M2 共鑒定出31 種揮發性物質，相對含量最高的為醚類物質，其中茴香腦占了44.91%，是其他腐乳相對含量的2～374 倍；烴類物質是在M1 和M2 中被檢出揮發性物質中種類和含量都較高的成分。C1 和C2 共鑒定出揮發性物質分別為27 種和14 種，二者中檢出的乙醇是相對含量最高的醇類物質，分別為58.70%和59.45%。C1 和C2 中的酯類物質相對含量較M1 和M2 檢出率高，分別為13.03%和39.93%。

表1 4 種腐乳揮發性物質GC-MS 鑒定結果Table 1 Identification of aroma compounds in four kinds of fermented soybean curd by GC-MS

續表 1

根據腐乳中檢測出的揮發性物質繪制韋恩圖（圖2），可見4 種不同腐乳間的風味物質種類和含量區別均較大。共有的風味物質只有茴香腦1 種；M1、C1 和C2 共有風味物質有2 種，分別是癸酸乙酯和棕櫚酸乙酯；C1 和C2 共有風味物質有5 種，分別是乙醇、月桂酸乙酯、亞油酸甲酯、9-十八酸乙酯和油酸乙酯；M1 和C1 共有風味物質有3 種，分別是苯乙醇、1,2,3,4,4a,5,6,8a-十八氫-7-甲基-4-亞甲基-1-（1-甲基乙基）-萘和2,6-二甲基-6-（4-甲基-3-戊烯基）雙環[3.1.1]庚-2-烯；M2 和C1 共有風味物質有2 種，分別是（-）-α-蒎烯和（S）-β-沒藥烯；M1、M2 和C1 共有風味物質有6 種，分別是（1S,8aR）-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氫萘、（1S-順式）-1,2,3,4-四氫-1,6-二甲基-4-（1-甲基乙基）-萘、β-石竹烯、α-木烏龍烯、正十五烷和正十七烷；M1 和M2 共有風味物質有8 種，分別是4-異丙基甲苯、1-甲基-4-（1-甲基乙基）-1,4-環己二烯、3-蒈烯、（4aS-順式）-2,4a，5,6,7,8,9,9a-八氫-3,5,5-三甲基-9-亞甲基-1-苯并環庚烯、順式-（-）-2,4a,5,6,9a-六氫-3,5,5,9-四甲基（1H）苯并環庚烯、（R）-β-雪松烯、正十四烷和正十六烷。

2.2 主體風味物質的分析

風味物質的相對含量的高低并不能說明其對樣品整體風味的貢獻程度，還需結合風味物質的閾值進行評價，不同化合物的閾值不同，一些風味物質雖然相對含量很低，但由于其閾值低，對整體風味貢獻也很大[20]，當其相對含量一定時，閾值越低的化合物越容易被嗅覺器官感知[21]。通過查閱書籍及相關文獻中已報道的揮發性風味物質的香味閾值，共找到25 種揮發性物質的氣味閾值（表2）。因此，本實驗只對查到閾值的風味物質進行分析。茴香腦是M1 和M2 中相對含量最高且閾值較低的風味物質，對這兩個樣品的整體風味貢獻最大，因此定義茴香腦為M1 和M2 的主體風味物質（Tstan=100）；乙醇是C1 和C2 中相對含量最高的物質，但閾值較高，所以定義相對含量較高且閾值較低的茴香腦和棕櫚酸乙酯分別為C1 和C2 中風味貢獻最大的物質（Tstan=100）。

按1.2.3 計算ROAV 值，結果見表2，乙醇、苯酚、茴香腦、β-石竹烯、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚、水楊酸甲酯、3-苯丙酸甲酯、3-苯丙酸乙酯、γ-壬內酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯和油酸乙酯是4 種腐乳的主體風味物質，大部分為酯類，這和Chung[28]的研究結果一致。對腐乳的整體風味有重要修飾作用的風味物質分別為苯乙醇、1-甲基-4-(1-甲基亞乙基)環己烯、對傘花烴、草蒿腦、二氫獼猴桃內酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯。

醇類物質大多具有令人愉快的氣味[29]，C1 和C2中檢測出的乙醇含量較高，酒香明顯，這與蔣芳芳[30]的研究結果一致，是C2 的主體風味物質，而M1 和M2 中的醇類物質檢出量低，這可能是由于本實驗對這兩種自制腐乳（湯汁較少）的采樣多為腐乳固形物。M1 和C1 中檢測出的苯乙醇是由蛋白質水解成的苯丙氨酸在酶解作用下代謝生成的，賦予了腐乳花甜香味，對M1 的整體風味有一定的修飾作用。

芳香族物質中的苯酚在白腐乳中也有報道[28]，可以防腐、殺菌，能夠延長腐乳的保質期，可能來源于酪氨酸的分解[31]，也可能是腐乳發酵過程中由木質素配糖體降解生成的[32]，賦予了M1 甜香味，是其主體風味物質；對傘花烴對M1 的整體風味有重要修飾作用。2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚是C1 的主體風味物質，賦予了其堅果香味。

烴類物質（萜烯類化合物除外）的產生可能和脂肪的分解有關[33]，本實驗檢測到的烴類物質包含長鏈烷烴和烯烴，烷烴類物質由于其分子量大，且氣味閾值較高[34]，香氣特征一般不顯著，所以對腐乳的總體風味貢獻不大，Shahidi 等[35]認為飽和烴和不飽和烴在食品風味形成過程中發揮的作用均不大，故此處不展開分析，而烯烴類物質中的萜烯類化合物閾值較低，具有花香、果香味，對總體風味貢獻較大，M1 和M2 中萜烯類物質種類豐富且相對含量較高，其中3-蒈烯多用于食用香精的配方[36]，可能與加入的香辛料有關，β-石竹烯是合成香料的原料，在M1、M2 和C1 中的ROAV 值均大于1，賦予了其辛香、木香味，是主體風味物質；(S)-β-沒藥烯具有木香、柑橘香、花香、果香、青香。

醚類物質主要來自于香辛料，具有強烈而愉快的香氣[37]。茴香腦是4 種腐乳種共同檢出的醚類物質，且相對含量較高且氣味閾值低，具有茴香、辛香料、甘草氣味。這與胡文康等[7]的研究結果一致；草蒿腦對M2 的整體風味有重要的修飾作用；間苯二甲醚賦予了M2 甜香、藥香、果香和啤酒香香氣。

酯類物質中多數小分子量的酯類化合物氣味閾值低，具有獨特氣味，對腐乳的總體風味貢獻較大，脂肪酸酯類物質的產生與腐乳發酵過程中醇和脂肪酸發生酯化反應有關[7,38-39]。分子量較大的酯類化合物閾值較高，但它們在腐乳中的濃度高于小分子量的酯類，所以對腐乳的風味貢獻很大。本實驗中檢出的乙酯類物質種類較多，且含量也較高，其中3-苯丙酸乙酯和水楊酸甲酯在M1 中的ROAV 值較大，分別賦予了樣品花香、果香和草藥香味[22]；棕櫚酸乙酯賦予了C1 奶油和酯香味；油酸乙酯賦予了C2 可可香味。

2.3 主體風味物質主成分分析

進一步比較這4 種腐乳主體揮發性風味物質的異同，本實驗選取對腐乳揮發性風味貢獻較大的物質進行主成分分析，結果見表3，根據特征值大于1 的原則[36]，共提取到2 個主成分，累計方差貢獻率達98.59%。

表3 主成分的特征值及其貢獻率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of the principal components

風味物質主成分載荷圖如圖3 所示，市購腐乳中的揮發性風味物質，如乙醇和棕櫚酸乙酯，與主成分2 呈現較強的正相關，而自制腐乳中的揮發性風味物質，如茴香腦、γ-壬內酯、3-苯丙酸甲酯、水楊酸甲酯和β-石竹烯，與主成分2 呈現較強的負相關，表明這兩類腐乳的主體風味物質的組成及相對含量有差異性，這可能與腐乳所使用的的原輔料及加工工藝有關。結合圖3 可知，乙醇是C1 和C2 整體風味的主要貢獻物質；茴香腦是M1 和M2 整體風味的主要貢獻物質。

圖3 主體風味物質的主成分載荷圖Fig.3 Principal component analysis loading plot of the key flavor compounds

3 結論

本實驗采用SPME-GC-MS 技術，從4 種腐乳中共檢測出74 種揮發性風味物質，包含醇類、芳香族類、烯烴類、烷烴類、醚類、酯類和酮類化合物等；結合ROAV 探討4 種腐乳的主體風味物質，分別是乙醇、苯酚、茴香腦、β-石竹烯、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚、水楊酸甲酯、3-苯丙酸甲酯、3-苯丙酸乙酯、γ-壬內酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯和油酸乙酯這；借助主成分分析知道茴香腦是M1 和M2 最主要的風味物質，乙醇是C1 和C2 最主要的風味物質。實驗結果表明自制腐乳和市購腐乳在主體風味物質及其相對含量上存在差異性，這可能與所用原輔料和加工工藝不同有關。研究結果將為腐乳特征揮發性風味物質形成機理的研究以及生產加工提供理論支撐。本研究由于實驗條件所限，未能采用氣相色譜-嗅聞-質譜聯用技術，今后可在樣品的前處理和檢測方法的多樣性上展開研究。