牛肝菌液態發酵及活性成分誘導培養研究進展

郭 磊，范方宇，劉 云，闞 歡

（西南林業大學生命科學學院，云南昆明 650224）

牛肝菌科（Boletaceae）真菌屬真菌界（Fungi）、擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricates），它既是高營養價值的真菌，也具有多種生理功效[1]。牛肝菌在全世界范圍內都有分布，在歐洲的瑞典、法國，美洲的美國，亞洲的馬來西亞、日本等國都有大量文獻記錄，中國已知牛肝菌有28 個屬387 個種（變種），主要分布在云、貴、川、粵等地區[2-3]。牛肝菌屬外生菌根真菌，對寄主有一定的選擇性，很難實現人工栽培[4]，故液態發酵培養將是以后牛肝菌研究的重要方向。

菌絲是牛肝菌液態發酵過程的重要產物，受各種發酵因素如培養基組成與比例、初始pH、發酵溫度及發酵時間等的相互影響，牛肝菌菌絲發酵體系的流變特性也隨之改變，進而影響到質量、熱量和動量的傳遞[5]，最終會影響到菌絲和發酵液中營養成分的生成和效率。同時，真菌液態發酵會產生多糖、色素、三萜類化合物及黃酮類化合物等次生代謝產物，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、促進植物生長等作用[6]。有些次生代謝產物結構新穎，生物活性獨特，是活性化合物研究的重要來源，且在抗腫瘤治療上具有不可替代的作用，近年來所發現的新結構、新活性次生代謝產物超過50%來源于真菌[7]。另外，通過物理、化學及生物外源誘導手段可以提高牛肝菌液態發酵過程中目標生物活性成分的含量,生產過程具有可再生性，且不受自然環境或資源限制，已成為牛肝菌資源高效利用的創新研究方向。

1 牛肝菌科真菌菌絲的液態發酵培養基研究

真菌培養基是供真菌菌絲生長繁殖或積累代謝產物的營養基質，根據菌絲對營養物質的需求來配制，培養基一般有碳源、氮源、無機鹽、生長素及水分等物質。不同培養基的成分是不同的，其中任何一種成分或含量的改變都會影響到菌絲的生長繁殖，各種培養基的成分與比例對菌絲的生長都會有較大影響。在真菌液態發酵過程中，除發酵培養基配方的影響外，初始pH、發酵溫度、發酵時間及轉速等也是影響真菌菌絲生長繁殖和代謝的重要指標。不同牛肝菌科真菌的液態發酵條件及菌絲生長情況見表1。

表1 不同牛肝菌液態發酵培養條件及菌絲生長情況Table 1 Liquid fermentation conditions and hyphae growth state of different Boletaceae fungi

通過優化培養基組成及發酵條件，牛肝菌菌絲體在營養素含量上遠高于子實體，有著更高的營養價值保健功能，具有非常大的發展潛力。美味牛肝菌號稱“牛肝菌之王”，是世界著名的食藥用真菌[19]，冮潔等[20]使用馬鈴薯200 g/L、葡萄糖25 g/L、蛋白胨7 g/L、K2HPO41.5 g/L、CaCl20.005 g/L 在初始pH5.0 時制備美味牛肝菌液態培養基，研究發現菌絲體蛋白質含量（28.40%）高于子實體（25.10%），菌絲體氨基酸總量（22.56%）也高于子實體（17.93%）。通過優化牛肝菌液態發酵的各種條件，能夠在短時間內產生大量的菌絲體，克服了人工栽培難度大和對給生態環境帶來的破壞，同時也能夠獲得和子實體相似的營養成分和代謝產物，具有廣闊的市場發展前景。

2 牛肝菌中生物活性成分的液態發酵培養

牛肝菌含有多糖、萜類、甾體、色素及生物堿等多種成分，具有抗氧化、抗腫瘤和抗菌等多種生物活性，是安全、有效、低毒的天然藥物分子來源，在疾病治療上有著較大的發展潛力[2]。目前，牛肝菌生物活性成分的獲取多來自于子實體，受自然資源條件的限制，原料來源有限且產量少，而液態發酵可以大量生產目標代謝活性成分，具有可再生性，有重要的科學研究意義。

2.1 胞外多糖

真菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）具有高黏性、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學活性[21]。但目前對牛肝菌發酵產EPS 的研究較少（見表2），如何獲得并通過真菌誘導提高牛肝菌EPS 產量已經是科研人員新的研究方向。

表2 牛肝菌EPS 發酵培養條件Table 2 Fermentation conditions of EPS from Boletaceae fungi

楊玉紅等[23]對美味牛肝菌EPS 發酵因素研究后發現，影響EPS 產量較大的三個因素分別是葡萄糖、硫酸錳和磷酸二氫鉀。在EPS 生產過程中，除通過控制發酵培養條件外，提取及純化技術同樣是提高EPS 產量及質量的關鍵因素。矯麗曼[27-28]研究了美味牛肝菌EPS 的提取純化工藝及單糖組成，結果表明超聲波協同酶法提取EPS 優于熱水法、超聲波法、酶法及超聲波協同酶法對美味牛肝菌菌絲多糖的提取效率，EPS 提取率達到8.315%。采用DEAE 纖維素柱和G-100 葡聚糖凝膠柱對其純化后發現EPS 是由D-木糖、D-甘露糖和D-半乳糖組成,摩爾比為3.1:63.3:1.0。闞國仕等[29]通過抗氧化活性研究發現美味牛肝菌EPS 對超氧陰離子自由基和羥基自由基有顯著的清除能力,還能夠抑制小鼠肝組織中丙二醛的生成、肝組織自發性脂質過氧化及減少紅細胞氧化溶血。許春平等[25]分析了脫蛋白后銅色牛肝菌EPS 的體外抗氧化活性，研究得出EPS 對ABTS 自由基、DPPH 自由基及超氧陰離子自由基具有很好的清除能力。

真菌EPS 生產周期短，不受季節、地域和病蟲害等限制，已作為增稠劑、乳化劑及穩定劑在食品工業中得到廣泛應用，并作為血漿替代品、抗腫瘤、降血糖及降血脂藥物在醫藥行業中有著非常廣泛的應用[30]。

2.2 色素

真菌色素是真菌發酵產生的次生代謝產物，其生產安全性高且易于大規模生產，具有廣闊的市場的發展前景[31-32]。在過去的二十年里，關于陸地和海洋生態系統中微生物色素有了深入的研究，包括微生物色素和癌癥相關性的研究[33]。到目前為止，微生物，包括細菌、真菌和藻類，都已經被證明是天然色素的良好替代來源。方瓊等[34]通過Plackett-Burman 試驗篩選出影響遠東疣柄牛肝菌（Leccinum extremiorientale（L.Vass.）Sing.）發酵產色素的影響因素主要是裝液量和培養時間，并通過響應面設計優化出色素的最佳發酵條件是麥芽糖20 g/L、玉米漿干粉5 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、VB10.01 g/L、培養溫度27 ℃、培養時間141.85 h、裝液量87.70 mL，此條件下發酵液的吸光度為0.532，比優化前提高了11.37 倍。

真菌的次生代謝物色素是食品天然色素和食品添加劑的良好來源，包括紅曲黃素（ankaflavin）、β-胡蘿卜素（β-carotene）、角黃素（canthaxanthin）、核黃素（riboflavin）、番茄紅素（lycopene）、紅斑素（rubropunctatin）及黑色素（melanin）等，具有抗氧化、抑菌、抗癌及抗細胞毒性等多種生理功能[35-36]。目前，雖然對牛肝菌科真菌發酵產色素的研究相對較少，但由于其安全性高、生產周期短且具有較高的營養價值和藥理活性，必將成為牛肝菌科真菌中天然色素生產的新途徑。

2.3 其他

三萜類化合物（triterpenoids）是真菌中除了多糖外最重要的生物活性成分，是由數個異戊二烯去掉羥基后首尾相連構成的萜類化合物，具有預防心腦血管疾病、增強免疫力及抗腫瘤等多種生理功能[37-38]。近年來已對靈芝（Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.）[39]、粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus(Bull.)Pat.）[40]及樺褐孔菌（Fascoporia oblique（Pers.Fr.））[41]等藥用真菌液態發酵菌絲的三萜類化合物進行了提取和生物活性研究。但截止到目前，對牛肝菌子實體及發酵菌絲中的三萜類化合物都沒有相關報道，因此對于牛肝菌三萜類化合物的發酵培養、誘導合成及生物活性研究是牛肝菌活性成分研究和資源開發利用的重要方向。

殼聚糖（chitosan）是唯一的天然堿性陽離子多糖，因其獨特而優越的成膜性、抗菌性、生物相容性及安全性等而受到國內外學者的廣泛關注，已應用到食品、藥品和化妝品等多個行業[42-43]。李昊[44]篩選出葡萄糖和酵母浸出粉是影響美味牛肝菌發酵產殼聚糖的主要因素，通過響應面優化出最佳的發酵條件是葡萄糖30.53 g/L、酵母浸出粉7.02 g/L、溫度28 ℃，裝液量77.42 mL，初始pH 5.64，發酵6 d，此條件下殼聚糖產量可達3.81 g/L，占菌絲體干重的15.43%，且具有較高的脫乙酰度和純度，對大腸桿菌也具有較好的抑制活性。

L-茶氨酸（L-theanine）是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，也是茶葉的重要活性成分，因其具有抗氧化、改善情緒與認知及減輕焦慮等生理作用，于2014 年被我國批準其為新食品原料[45-46]。L-茶氨酸也存在于牛肝菌科真菌中，李健[47]通過毛細管電泳分析出褐絨蓋牛肝菌（Xerocomus badius（Fr.）Kiihner ex Gilb.）、粘蓋牛肝菌、黃柄牛肝菌和茶褐牛肝菌（Boletus brunneissimusChiu）的L-茶氨酸含量分別是29.86、27.35、25.61 和15.60 mg/100 g,并研究獲得了褐絨蓋牛肝菌液態發酵產L-茶氨酸的最佳條件是29.17 g/L 葡萄糖、6.38 g/L 酵母膏，裝液量61.43 mL和初始pH5.63，L-茶氨酸產量達到17.22 mg/mL。粘蓋牛肝菌產L-茶氨酸的液態發酵組合是30.12 g/L葡萄糖、6.77 g/L 酵母膏，裝液量60.10 mL 和初始pH5.58，在此條件下L-茶氨酸的產量達到15.15 mg/L，研究結果為牛肝菌液態發酵產L-茶氨酸提供了一條新路徑。

利用液態發酵技術生產牛肝菌代謝物質已經是獲取生物活性成分的有效途徑，通過改變培養基組成和發酵條件來獲取不同的牛肝菌代謝物，進一步分析代謝物質的結構和功能，為保健食品和藥品的研發提供了新的依據，也牛肝菌資源的開發與利用指出了新的研究方向。

3 牛肝菌液態發酵產物的誘導培養

在真菌液態發酵的過程中，胞外多糖、三萜類化合物、酚類化合物及生物堿等多種具有生物活性的代謝產物也隨之產生，這些代謝產物生物活性強，毒副作用低，成為安全、有效、低毒且來源豐富的天然活性物質來源。近年來，為了促進真菌液態發酵過程中生物活性代謝成分的生成，常通過紫外光照射、添加茉莉酸甲酯、水楊酸、金屬離子及真菌誘導子等物理、化學和生物外源誘導技術手段進行調控，進而誘導真菌液態發酵過程中代謝產物的生成，己成為真菌活性成分及其藥物研究領域的新熱點。

3.1 物理誘導培養

光照、紫外光照射、溫度變化、機械損傷、超聲、X 射線及電磁處理等是影響真菌液態發酵的物理誘導方式，其中紫外光照射會對真菌次生代謝產生重要影響，尤其會顯著提高黃酮類化合物的產量[48-49]。紫外輻射作為一種危害性脅迫，可以激發植物體產生一系列的防御性反應，這些反應增加了大量黃酮類化合物及其它能夠吸收紫外光的化合物，能夠抵御照射到植物的大部分紫外光，減輕了植物被紫外光傷害的程度，同時也促進了大量類胡蘿卜素的產生，保護了植物的光合體系[50-51]。

陽飛[52]首次采用原生質體紫外線-氯化鋰（UVLiCl）復合誘變的方法選育出美味牛肝菌EPS 高產菌株，并對誘變株（UL-7）發酵工藝進行了研究，在相同液體培養基下EPS 產量可達到4.361 g/L，高出未經誘導的EPS 產量的37.8%。隨著次生代謝活性成分研究的不斷的發展，物理誘導也為促進牛肝菌代謝產物的產生開辟出一條新途徑。

3.2 化學誘導培養

化學誘導劑如中藥、中藥提取物、油脂類物質及金屬元素都是提高真菌代謝產物的重要手段，它能改變真菌代謝途徑中關鍵酶的活性，通過快速、專一和選擇性地誘導真菌特定基因的表達而促進細胞的合成和特定代謝產物的積累，從而達到促進真菌代謝產物產生的目的[53]。

王明慧等[54]研究培養基中水楊酸對褐環粘蓋牛肝菌菌絲生長量的影響，發現水楊酸濃度在（4.76×10-10）～（4.76×10-6）g/mL 之間對菌絲產量有促進作用，當水楊酸濃度在2.38 × 10-10g/mL 時，菌絲生物量達到最大值420 g/L 左右，遠高于沒有經過化學誘導的菌絲產量91.86 g/L。苗廷廷[55]研究了磚紅絨蓋牛肝菌菌絲在含有大米和麩皮的培養基中的生長狀況，發現在接種7～10 d 后，菌絲在含有大米的培養基上生長速度快，而在添加麩皮的培養基上，直到20～25 d 后才表現出了極好的生長趨勢，且菌絲粗壯致密，菌絲在添加大米或者麩皮的培養基上的生長性狀更好。

目前，將化學誘導劑添加到牛肝菌發酵培養基中來調控次生代謝產物的合成還未見報道，但在其他真菌方面有過報道，如在靈芝液體發酵液中加10 mmol/L Ca2+后，多糖含量比對照提高34%，三萜含量比對照提高64%，而在發酵液中加150 μmol/L水楊酸后，多糖含量比對照提高57.54%，三萜含量比對照提高37.19%，靈芝液體發酵12 d 時加10 mmol/L Ca2+和150 μmol/L 水楊酸，三萜含量比對照可以提高46.9%[56]。在樺褐孔菌液態培養第6 d 時添加50 mmol/L 茉莉酸甲酯（添加量為2 μL/mL）時，總三萜產量在發酵第9 d 時，最大達81.74 mg/100 mL，比對照的總三萜產量（60.76 mg/100 mL）提高了34.5%。而亞油酸、油酸和軟脂酸也能促進樺褐孔菌在發酵過程中總三萜的積累[57]。由此說明，通過化學誘導促進牛肝菌三萜類化合物的合成是完全可行的，也為藥物研究者指明了開發高效、低毒的抗癌藥物新的研究方向。

3.3 生物誘導培養

生物誘導子是指微生物或者來源于微生物的成分，包括細菌、真菌（孢子和菌絲體）、酵母、微生物細胞壁成分、微生物蛋白質及脂類成分、微生物代謝產物、酵母提取物等[50]，采用真菌誘導子誘導特定次生代謝產物已成為近年來的研究熱點。真菌誘導子（fungal elicitors）是一類來源于真菌且能夠誘導細胞生長和次生代謝產物合成的化學物質，包括有真菌菌體、菌液濃縮物、菌絲和菌液提取物、菌絲體高溫處理后的可溶性成分、細胞壁降解成分、肽類和蛋白質等[58]。

段慧[59]分析了平菇汁不同處理方式對褐環粘蓋牛肝菌菌絲生長量的影響，結果發現添加10%平菇汁的培養基在發酵15 d 時菌絲生長速度最快，菌絲干重比對照提高了158%。平菇汁75%乙醇萃取后得到的沉淀進行脫蛋白分離得到粗多糖，將不同濃度粗多糖溶液添加到培養基后發酵12 d，并在粗多糖溶液添加量為0.2 g/50 mL 時，菌絲干重高于對照達98%。趙磊[60]研究得出平菇汁乙醇透析液中的多肽含量與褐環粘蓋牛肝菌菌絲生長量呈正相關，促進菌絲生長的真菌誘導子為透析液中的非脂溶性蛋白質或多肽。

在真菌液態培養基中加入外源誘導因子可以改善代謝途徑中的基因表達與酶活，進而提高真菌代謝產物的生成量，具有較強的特異性[61]。目前，雖然對于誘導子的篩選及在真菌液態發酵中的應用方面有一定的研究，但對新型誘導子的研究特別是真菌誘導子篩選、誘導機理及調控機制方面，還存在很多的研究空白。因此，深入研究誘導子的誘導機理，篩選出高效誘導子加入到牛肝菌液態發酵培養基中，提高目標代謝產物及其生物合成產量，實現牛肝菌資源的高值化利用，具有重要的科學研究價值。

4 結論

采用真菌液態發酵方式培養菌絲及生物活性成分，不受自然資源環境限制，具生產周期短、便于精確控制等優點，能夠進行大批量生產。另外，通過改變液態培養基基質組成、發酵培養條件、外源誘導等手段優化真菌次生代謝產物的生成，已成為食品及醫藥行業獲取功效成分的新途徑，具有重要的科學研究意義。牛肝菌資源來源豐富、營養價值和藥用價值高，在液態發酵過程中利用外源誘導技術促使其產生豐富且生物活性好的代謝產物，不僅為牛肝菌科真菌液態發酵制備生物活性成分奠定一定的理論基礎，也將成為牛肝菌科真菌資源高效利用的新方向。