聚乳糖-殼聚糖和聚乳糖-聚己內酯新型人工胸壁復合材料研究

王 晨，鄒青旭，姜靜遠，張春玲，林風武*

（1.吉林大學中日聯誼醫院，長春 130033；2.吉林大學材料科學與工程學院，長春 130000）

胸壁缺損患者一直飽受疾病的折磨，胸壁缺損的治療也成為廣大醫療工作者面臨的一個難題[1]。胸壁腫瘤根治術后的患者，一般會出現大面積的胸壁缺損[2]。除此之外，交通事故、高墜傷等外傷中大多數伴有肋骨骨折，比例達85%[3]。肋骨骨折的患者胸廓缺乏肋骨的支撐，容易出現反常呼吸活動以及呼吸道感染。若損傷嚴重，甚至會威脅到患者的生命安全[4-5]。因此，一般對上述患者進行胸廓重建，修復患者胸廓原有的外觀及胸壁的完整性，以維持胸腔內封閉、負壓的環境，保證呼吸運動的正常進行[6]。合適的胸壁替代物是胸壁重建成功的關鍵。研究[7-8]顯示，對于胸壁缺損范圍較大者，目前大多數臨床醫生建議優先選用可吸收生物材料進行修補。

“三明治”式結構既綜合了條狀、板狀材料硬的特點，又吸納了網狀材料軟的優點，是目前胸壁缺損替代物的最佳方案[9]。但目前臨床上用于“三明治”式結構的人工材料難以滿足多樣化需求。隨著科技的進步，人們發現人工高分子材料可媲美天然高分子材料，其在外科學中受到重視[10-12]。研究表明，聚乳糖（PLLA）和和殼聚糖（CHS）兩種材料在體內具有良好的溶解性，且殼聚糖具有價格便宜、貯量較多、降解性能良好等優點，與聚乳糖有誘發非感染性炎癥的風險及價格高昂的缺點相中和，具有一定的使用前景[13]。

1 材料和方法

1.1 設計

觀察性實驗。

1.2 實驗時間及地點

2020年3月－9月于吉林大學動物實驗中心進行一系列實驗。

1.3 材料

實驗動物 ：由吉林大學動物實驗中心提供，10只7～9周齡家兔，體質量2.0～2.7 kg，平均（2.4±0.1）kg。將10只家兔分為2組，每組各5只。2組家兔分開進行飼養，飼養完全遵守規范家兔飼養，各項操作均按《關于善待實驗動物的指導性意見》進行[14-15]。

1.4 實驗方法

聚乳酸纖維（PLLA）和殼乳糖纖維（CHS）交織織物的制作，由吉林大學材料學院提供。

1.4.1 聚乳酸（PLLA）/聚己內脂（PCL）復合材料（人工肋骨板）的制備 將PLLA和PCL切片按一定比例混合，加入到準備好的模具中加溫，溫度上升至200 ℃時開始加壓，加壓至10 Mpa。在此溫度和壓強下維持10 min，待聚合物充分反應后立即冷卻，脫模取樣。再將試樣放入平板模具腔中，在80℃下預熱5 min后，逐漸加壓至8 Mpa。維持該溫度與壓力10 min，然后慢慢冷卻，至室溫時將材料取出。

1.4.2 新型“三明治”胸壁替代材料的制作 取制備好的聚乳酸纖維和殼乳糖纖維交織織物上下各一層覆蓋于已制好的人工肋骨板表面，制成新型“三明治”型人工胸壁替代材料。

1.4.3 新型PLLA和CHS復合交織織物的性能 1）力學性能檢測：使用材料試驗機檢測復合交織織物力學性能。2）復合織物表面形態觀察。3）交織織物與細胞的聯合培養：將一片充分浸潤后的復合交織織物置于細胞培養板上。然后將每毫升1×106個細胞濃度的成骨細胞（細胞株是由中科院上海細胞研究所提供的Hfob1.19 SV 40 轉染成骨細胞）懸液加于培養板復合材料的表面。然后將培養板置于CO2培養箱（日本SAYAN公司）中培養。觀察成骨細胞在復合材料上的存活情況、細胞形態及相互之間相容性。

1.4.4 聚乳酸（PLLA）/聚己內酯（PCL）共混板材（人工肋骨板）的性能 彎曲性能測定：參照GB/T16419-1996規定的試樣尺寸20 mm×3 mm×1 mm，跨度L=16 h，在15 ℃，濕度68%，實驗速度2.5 mm/min的測試條件下測量，測量儀器為上海華龍測試儀器廠生產的微機電子萬能試驗機。

1.4.5 新型“三明治”胸壁替代材料的性能 1）急性全身毒性實驗：10只大鼠，隨機分為2組。實驗組大鼠經靜脈注射上述所有受試材料的浸泡液，劑量50 mL·kg-1。對照組大鼠采用0.9%生理鹽水按同樣的方式經靜脈注射，劑量與實驗組保持一致。觀察實驗大鼠在注射后的反應情況，包括大鼠的一般狀態、不良反應和有無致死情況（分別于1 d后、2 d后、3 d后各觀察記錄1次）。2）體內降解實驗：新西蘭白兔1只，麻醉后沿兩側腹部劃開皮膚，分離肌層后將備好的各類受試材料放入，共4組。于術后4、8、12、24周時，分別取出之前備好的1、2、3、4組材料組織及周圍纖維包膜和軟組織，觀察新型復合材料溶解情況。3）細胞毒實驗：將受試材料和其他陽性、陰性對照材料分別置于6孔板中。取濃度為6×104·mL-1的第三代的豬骨髓干細胞細胞懸液3 mL加入到培養皿內，各組設置平行樣品6個。每天用血細胞計數器進行計數，鏡下觀察受試材料表面及其邊緣細胞的形態和生長情況。4）溶血實驗：在37 ℃恒溫水浴箱內保溫30 min。將按新鮮抗凝血:生理鹽水4:5的比例制成稀釋兔血0.2 mL放入提前備好的試管中，按試樣組、陽性、陰性對照組各設平行樣品5個，隨后將溶于生理鹽水中（5 g 置于10 mL 0.9%生理鹽水中）的試樣放入各試管內。37℃恒溫水浴箱中保溫1 h后離心5 min，隨后取上清液在545 nm波長下測其吸光度[16]。

1.4.6 胸壁缺損實驗動物模型的創建及改良“三明治”胸壁替代材料性能 取實驗中心飼養的10只家兔，麻醉后機械通氣。取前外側橫行切口用手術刀切開長約5 cm切口，用手指鈍性分離肌肉以暴露肋骨，然后將家兔第5、6肋骨連同肋間肌完整取出。實驗組使用新型復合型人工胸壁材料進行修補，補片四周用可吸收縫線縫合于周圍軟組織和肋骨斷端。表面將胸壁肌肉覆蓋縫合，隨后縫合皮膚。對照組將缺損兩側肌肉行單純間斷縫合。無菌紗布覆蓋、包扎。為預防感染，術后予家兔青霉素肌注處理。

1.5 主要觀察指標

1）觀察新型聚乳酸纖維和殼乳糖纖維交織材料的力學性能、表面形態觀察、以及細胞在交織織物上能否正常生長，細胞與材料有無明顯排異現象；2）觀察聚乳酸（PLLA）/聚己內酯（PCL）合成材料的彎曲性能；3）觀察新型復合型人工胸壁材料的急性全身毒性實驗、體內降解實驗、細胞毒實驗、溶血實驗。

1.6 統計學方法

數據采用SPSS 21.0進行統計學處理，計數資料使用 χ2檢驗，用率（%）表示；計量資料使用t檢驗，采用均數±標準差（±s）表示，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析

所有實驗家兔數據均被納入分析。

2.2 新型PLLA和CHS復合交織織物的力學性能測試

實驗研究表明，PLLA/CHS混合織物的力學性能優于單純的聚乳酸纖維織物（PLLA/CHS混合織物斷裂強力為28N，而PLLA織物為23N)。因此，新型PLLA和CHS復合交織織物的力學性能表現更優秀。

2.3 新型PLLA和CHS復合交織織物的表面形態觀察

該實驗分別間隔1個月取出實驗標本進行觀察，共觀察5次。觀察過程中發現，早期時變化并不明顯，至5個月時可見明顯的溶解表現。

2.4 新型PLLA和CHS復合交織織物與細胞的聯合培養結果

培養3 d后在電鏡下觀察交織織物與成骨細胞聯合培養的結果，發現在復合交織織物纖維周圍附著有較多的成骨細胞，細胞成多角形，生長良好。表明新型交織織物能夠為細胞提供附著和生長的環境。

2.5 聚乳酸/聚己內酯共混板材彎曲性能測定

根據實驗數據發現，PLLA/PCL共混材料的彎曲性能與人體組織接近，能給予機體足夠的骨性支撐。見表1。

表1 聚乳酸/聚己內酯共混板材彎曲性能測定結果

2.6 新型復合型人工胸壁材料的急性全身毒性實驗

分別于24、48、72 h對實驗大鼠進行觀察及測質量。所有大鼠均無死亡，無明顯毒性反應（嘔吐、驚厥、呼吸抑制等反應），飲食與大小便同前。監測體質量發現實驗組體質量略為增加，72 h監測為（0.79±0.12）g，與對照組（0.67±0.14）g相比無較大差異（P＞0.05)。因此，我們認為新型復合材料為無毒材料。

2.7 新型復合型人工胸壁材料的體內降解實驗

研究發現，新型復合材料在體內約5周時質地較前變軟，9周時材料在體內溶解縮小，完全喪失骨性支撐。

2.8 新型復合型人工胸壁材料的細胞毒實驗

鏡下發現觀察期內細胞成多角形形態，生長良好。MTT比色結果顯示，OD值由開始時（1.016±0.012）逐漸升至（2.928±0.427），表明實驗材料不會對細胞產生嚴重的不良反應，新型材料安全可靠。細胞計數結果，見圖1。

圖1 連續6 d監測細胞數目變化情況

2.9 新型復合型人工胸壁材料溶血實驗

實驗用陰性對照組（吸光度＜0.03）和陽性對照組[吸光度（0.8±0.30）]吸光度均復合要求，且實驗組溶血率為3.3%，符合國家對醫用生物材料的要求（溶血率＜5%），新型材料可安全使用。見表2。

表2 新型復合型人工胸壁材料溶血實驗結果

2.10 胸壁缺損動物模型不同治療方案下恢復情況

實驗組家兔精神狀態、飲食、大小便均正常，切口愈合良好，傷口處Ⅰ /甲級愈合。根據家兔術后引流量情況酌情拔管（約術后6～9 d），實驗組5例家兔術后均未發現發燒、腹瀉癥狀。對照組家兔術后精神狀態、飲食情況稍差，但也無發燒、腹瀉等感染表現，引流管拔除及傷口處理情況與實驗組相同。

3 討論

胸壁缺損的修復即修復胸壁原有骨性組織及修復原有軟組織結構。首先，各種原因導致的骨性成分的損傷修復必須依靠有一定機械強度的人工材料支撐，恢復胸廓原有形態，防止反常呼吸，保護胸腔內臟器。胸壁損傷進行骨性重建，一般通過胸壁損傷的位置和大小來決定是否有必要。一般認為，對于前胸壁損傷的患者，如果損傷范圍＜5 cm，則無須進行骨性重建處理；對于后胸壁損傷的患者，如果損傷范圍＜ 10 cm或者單根或雙根的骨折，也無須進行骨性重建[17-19]。此外，對于胸骨損傷以及胸壁全層損傷造成嚴重以及胸壁全層損傷，造成患者反常呼吸，呼吸困難者，也應進行骨性重建。人的胸廓本身是一個封閉、負壓環境，軟組織的重建對于維持該環境顯得尤為重要[20]。一般在術中多采用將損傷周圍組織與網狀人工材料進行縫合[21]。胸壁修補術需考慮患者損傷情況、患者家庭經濟水平以及醫療機構水平等多個方面，目的是維持正常的胸廓形態、保護胸腔臟器、防止發生反常呼吸以及維持自身封閉和負壓環境。

胸壁缺損的人工胸壁復合材料選擇非常重要：復合材料要有良好的生物相容性，不會對機體正常組織細胞產生嚴重的不良反應；復合材料要有骨性材料特點，對骨性缺損部位產生一定支撐作用；材料易于降解，避免長時間殘留于機體內引起感染；材料性質穩定，在材料的加工制作、運輸使用時不易發生變性；材料能提供易于細胞附著和生長的環境；對患者術后正常的生活及健康、檢查不會產生影響[22-24]。

通過對新材料的實驗研究發現，新型復合型人工胸壁材料實驗結果良好,乳糖-殼聚糖和聚乳糖-聚已內脂新型人工胸壁復合材料具有一定應用前景。隨著科技和認知的不斷進步，人們對醫療健康的認識也有了從質到量的轉變。人們關注的焦點已不再是局限于疾病的臨床療效結果，更關注治療本身帶來的生活質量問題。近年來，隨著越來越多人工胸壁復合材料出現，人工胸壁材料獲得了巨大的發展，并且隨著3D技術的普及應用于醫學，人工替代材料外科手術有了個體化的特點，也使胸壁缺損個體化修復成為可能[25-27]。然而，生物醫用人工胸壁的研發涉及多學科領域，僅僅靠一個團體，一個行業的努力遠遠不夠，需要各個行業團結協作，制造出更有益于患者治療的人工材料。