基于細胞自噬蛋白LC3、p62研究不同微粒的復方蜥蜴散對大鼠潰瘍性結腸炎的作用*

王藝臻，王佳林，朱西杰

1.寧夏醫科大學，寧夏 銀川750004；2.寧夏醫科大學附屬回醫中醫院，寧夏 銀川750004

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種結直腸的慢性炎癥性疾病，主要表現為腹痛、腹瀉、便血等，病程遷延難愈，被世界衛生組織列為疑難疾病［1－2］。細胞自噬具有防止病理產物積聚，處理細胞內損傷蛋白、衰老細胞器的功能，而LC3、p62為細胞自噬的主要蛋白標志物。本研究將基于自噬蛋白LC3、p62研究不同微粒的復方蜥蜴散對2，4，6－三硝基苯磺酸（2，4，6－trinitro－benzenesulfonic acid，TNBS）誘導UC模型大鼠的影響，為復方蜥蜴散尋找可能相關的細胞自噬靶點，為中醫藥治療UC提供新思路。

1 材料

1.1 動物SPF級健康雄性SD大鼠42只，6～8周齡，體質量180～220 g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（寧）2015－0001，飼養于寧夏醫科大學動物房，12 h／12 h的光照／黑夜循環，溫度（22±2）℃，濕度45%～50%，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑復方蜥蜴散（蜥蜴15 g，黃芪30 g，黨參15 g，山藥15 g，白術15 g，延胡索10 g，枳殼15 g，砂仁10 g，旋覆花10 g，佛手10 g，白芍15 g，烏梅10 g，半夏10 g）（寧夏醫科大學附屬回醫中醫院，批號：20180632）；柳氮磺吡啶（美國Sigma公司，貨號：901553－1G）。LC3、p62、β－actin、山羊抗兔二抗抗體［柏奧易杰（北京）科技有限公司，批號分別為：bs－8878R、bs－2951R、BE0021、BE0101］；ECL發光液（南京凱基生物科技發展有限公司，貨號：KGP1127）；蛋白marker（美國Thermo公司，貨號：26616）；Tris、PBS磷酸鹽緩沖液［范德（北京）生物科技有限責任公司，貨號分別為：SS1426、IH0132］；TNBS（美 國Sigma公 司，貨 號：IPVH00010）；PVDF膜（Millipore公 司，貨 號：IPVH00010）；TBST、BCA蛋白定量試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號分別為：p25133、KGPBCA）；脫脂奶粉（美國BD公司，批號：0252038）；甘氨酸［范德（北京）生物科技有限責任公司，批號：20180306］；SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液（凱基生物科技發展有限公司，貨號：KGP101X）；甲醇（天津市永大化學試劑有限公司，批號：20200903）；SDS（日本Wako公司，貨號：CAH4859）；水合氯醛（天津大茂公司，批號：20201007）。

1.3 儀器BP310P型稱量天平（Sartorius公司）；centrifuge5417R型低溫高速離心機（Eppendorf公司）；MDF－U72V型超低溫冰箱（SANYO公司）；電泳儀（美國Bio－Rad公司）；RM2016型切片機（德國萊卡LEICA公司）；SI－0246型旋渦混合器（美國SI公司）；CKX41型光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；XR型凝膠成像分析系統（美國Bio－Rad公司）。

2 方法

2.1 藥物制備不同微粒的復方蜥蜴散：復方中藥經過粉碎、高溫滅菌后，蒸2.5 h，晾曬1周干燥后，分別過80目篩（復方蜥蜴散80目）和過100目篩（復方蜥蜴散100目），將80目篩和100目篩的不同微粒按照1∶1等量混合（復方蜥蜴散100＋80目），用雙蒸水煎煮濃縮后制成每毫升含0.15 g生藥的糊劑混懸液，經高溫滅菌后，4℃備用。

2.2 動物分組、造模及給藥將36只SD雄性大鼠，隨機分為6組，即空白組、模型組、柳氮磺吡啶（0.3 g·kg－1）組、復方蜥蜴散80目（1.5 g·kg－1）組、復方蜥蜴散100目（1.5 g·kg－1）組、復方蜥蜴散100＋80目（1.5 g·kg－1）組，每組7只。用石蠟油潤滑的聚丙烯管（外徑2 mm）緩慢插入大鼠肛門上段8 cm結腸內緩慢注入5%TNBS（0.1 g·kg－1）與50%乙醇的混合液0.25 mL灌腸復制UC模型，空白組用0.25 mL生理鹽水灌腸。造模結束后，除空白組外，各組隨機抽取1只大鼠，取結腸，進行HE染色。若殺檢大鼠出現結腸炎性細胞浸潤、充血水腫及潰瘍等病理變化，及大鼠出現大便次數增多、糞質稀薄、黏液膿血便、食量減少、毛發晦暗無澤、消瘦拱背等則為大鼠UC模型復制成功。

造模成功后，各組灌服相應的藥物，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水，連續給藥14 d，觀察大鼠的表觀指標。

2.3 HE染色觀察大鼠結腸組織病理變化末次給藥后，大鼠禁食24 h，用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉。每組隨機選3只大鼠剖腹，取結腸，用40 ng·L－1甲醛固定。

脫蠟：用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟各10 min；入水：100%乙醇Ⅰ和Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min→自來水沖洗5 min→蘇木素染色10 min→自來水沖洗30 min→鹽酸乙醇分化15 s→自來水沖洗30 min→伊紅染色5～8 min→過水；脫水：70%乙醇1 min→80%乙醇1 min→90%乙醇5 min→95%乙醇5 min→100%乙醇Ⅰ和Ⅱ各5 min；透化：二甲苯Ⅰ和Ⅱ各10 min；中性樹脂封片；顯微鏡下進行觀察。

2.4 Western Blot法檢測大鼠結腸組織自噬相關蛋白的表達末次給藥后每組隨機選3只大鼠，取結腸。提取結腸組織蛋白并測定其濃度后將樣品進行變性，－80℃下分裝保存。

配制濃縮膠和分離膠后進行電泳，電泳前進行檢漏，加所需蛋白樣品并在最左側加入5μL的Maker，在200 V電壓下電泳30 min；將PVDF膜于甲醇中激活10 s，激活后的PVDF膜置于轉膜液中保存，切膠并放入轉膜液中，30 mA轉膜50 min；轉膜結束后，將PVDF膜置于雙層塑料膜間，并滴加1 mL轉膜液，裁剪所需要的蛋白條帶，PBST浸洗3次，每次15 min，封閉1 h；然后滴加200μL一抗，4℃過夜，次日將條帶置于PBST中，沖洗3次，每次10 min，滴加500μL二抗，室溫孵育1 h后，將條帶置于PBST中，浸洗3次，每次10 min，進行曝光，每個條帶滴加200μL的ECL發光液，暗室內曝光、顯影保存圖像。用Image J軟件對蛋白條帶圖進行分析。

2.5 統計學方法采用SPSS 21.0軟件進行處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析。假設檢驗采用雙側檢驗，取α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠的表觀指標模型組大鼠出現黏液膿血便、精神狀態萎靡、扎堆少動、毛色晦暗；復方蜥蜴散80目組、復方蜥蜴散100＋80目組、復方蜥蜴散100目組、柳氮磺吡啶片組黏液膿血便逐漸消失、精神狀態佳、活躍、毛色光潔，以復方蜥蜴散100＋80目組為優。

3.2 觀察結腸組織病理學空白組大鼠結腸黏膜表面光滑平整，大腸腺結構完整清晰可見，細胞形態正常，無炎性細胞浸潤；模型組結腸黏膜表面大面積破損凸凹不平，有膿腫及潰瘍面形成，腺體萎縮，細胞形態改變，大量炎性細胞浸潤，排列紊亂不規則；復方蜥蜴散100＋80目組和柳氮磺吡啶組結腸黏膜組織可見到炎性細胞浸潤，但明顯少于模型組；復方蜥蜴散80目組仍可見到浸潤大量炎性細胞，甚至達到黏膜下層，腺體結構不完整；復方蜥蜴散100目組無明顯變化。見圖1。

圖1 大鼠腸黏膜病理學改變（HE，×200）

3.3 Western Blot法檢測大鼠結腸組織p62、LC3蛋白表達與空白組比較，模型組大鼠結腸組織p62蛋白表達明顯下調，LC3 II／LC3 I水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，復方蜥蜴散100＋80目、復方蜥蜴散100目、復方蜥蜴散80目及柳氮磺吡啶組均可明顯上調p62蛋白表達，降低LC3 II／LC3 I水平（P＜0.05），以復方蜥蜴散100＋80目組為優。見圖2。

圖2 Western Blot法檢測大鼠結腸組織p62、LC3蛋白表達

4 討論

UC屬于中醫學“腸癖”“下利”“腹痛”等范疇，因飲食和情志內傷，復感外邪導致脾胃升清降濁功能失常，氣機斡旋失司，濁毒積滯于腸道，腸絡損傷，黏膜在缺血缺氧狀態下自噬激活，失于傳化糟粕和津液，腸黏膜血敗肉腐，化膿成癰，內成潰瘍而致本病發生［3－6］。正如《圣濟總錄·膿血痢》所言：“積熱蘊結，血化為膿，膿血相雜，故成膿血痢”。朱西杰教授采用復方蜥蜴散治療UC，通降濁毒、化瘀解毒、促黏膜血行、扶正以修復創面［7－8］。

方中選用中藥如補中益氣的黃芪、山藥，可扶助正氣，黃芪和山藥中的主要活性物質黃芪多糖和山藥多糖具有抗炎、調節自噬、改善氧化應激、提高機體免疫力的作用［9－10］。“去邪”是祛除“毒”“瘀”等邪氣，早在《黃帝內經》有云：“堅者削之……結者散之，留者攻之”，為治療癌瘤的基本原則。故采用解毒散結的蜥蜴為君，并以軟堅散結的生牡蠣，二者合用增強解毒散結之功；臣以半枝蓮、三七活血止痛，增強祛瘀生新之功效；酸收固澀的延胡索、海螵蛸合澀腸止瀉的烏梅與溫補的鹿角霜合用，共同發揮促進腸道蠕動的作用。藥理研究發現，寧夏密點蜥蜴及牡蠣酶解產物可降低體內炎癥因子水平，調節機體免疫活性；延胡索、海螵蛸、鹿角霜可抗血小板聚集、抑制白細胞減少、促進紅細胞生長及血管生成，具有加速潰口愈合的功效，三藥合用共同修復損傷的黏膜組織［11－12］。有研究顯示，烏梅提取物通過降低NF－κB p65蛋白表達和抑制脂質過氧化反應，從而減輕腸炎大鼠結腸黏膜組織中腸道水腫程度，以發揮預防潰瘍和減少贅生物形成的作用［13－20］。綜上，諸藥合用共奏扶正補氣血、解毒化瘀之功。葉天士在《臨證指南醫案》有云：“湯者蕩也，去大病用之；散者散也，去急病用之；丸者緩也，舒緩而治之也”。本復方在修復腸黏膜損傷中的給藥形式采用散劑以獲得較好療效，而散劑治療中顆粒的大小又是臨床療效的決定因素，故本研究選擇不同微粒的復方晰蜴散。

研究表明，LC3參與自噬形成到成熟的全部過程，當自噬發生時，LC3 I被活化，結合磷脂酰乙醇胺轉變為LC3 II，通常以LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值判斷自噬水平的高低［21］。p62作為調控蛋白和泛素蛋白的聚集物作用中心，參與調控蛋白代謝及傳導多個信號通路，是隔離有害蛋白的泛素結合保護器［22－25］。已有研究顯示，p62與自噬標志物蛋白LC3共定位可防止有害蛋白在體內存積，二者免疫共沉淀參與細胞自噬的修飾與延伸，在自噬研究中起到積極作用［26－29］。本實驗結果顯示，復方蜥蜴散100＋80目組為優，能明顯降低大鼠結腸黏膜上皮細胞中LC3 II／LC3 I水平，上調p62表達，其表達趨勢與復方蜥蜴散可解毒化瘀，促進腸黏膜血液循環，修復受損腸黏膜，促進腸道有害物質向營養及能量轉化，使潰瘍創面得以愈合相一致［30］。通過維持正常細胞自噬的作用，清除細胞內受損的細胞器、蛋白質，起到隔離有害蛋白，促進黏膜修復，降低結腸炎癥反應，緩解腸道平滑肌興奮痙攣的作用，為促進結腸功能的恢復提供有利的環境。