糞菌移植對慢加急性肝衰竭小鼠模型腸道菌群的影響

高 安，徐玉靜，陸圣威，孫 蔚，甘建和

蘇州大學附屬第一醫院 感染科，江蘇 蘇州 215000

慢加急性肝衰竭(ACLF)為慢性肝病基礎上，短期內出現急性肝功能失代償和肝衰竭的表現[1]。ACLF會導致腸道菌群失調、腸屏障功能受損、免疫功能下降[2]，越來越多的證據[3]說明慢性肝病與腸道菌群失調有關。近年來，腸道菌群在人體健康和疾病中起著至關重要的作用，并參與腸道內外慢性疾病的病理生理學[4]。基于腸肝軸理論，推測改善菌群失調對ACLF有保護意義，本實驗通過建立ACLF小鼠模型，研究ACLF小鼠腸道菌群變化及糞菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)對ACLF小鼠的安全性及保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用40只SPF級雄性C57BL/6小鼠，3～4周齡，實驗動物生產許可證編號為SCXK(蘇)2018-0006。實驗動物使用許可證編號為SYXK(蘇)2017-0042。實驗墊料、飼料經過輻照殺菌處理，飲用水經高壓滅菌處理，符合SPF級動物使用標準，溫度(24±2) ℃，濕度55%，小鼠自由攝取飼料和飲用水，光照與黑暗各12 h循環。

1.2 主要試劑 CCl4購自江蘇強盛功能化學股份有限公司，橄欖油購自國藥試劑網，D-氨基半乳糖(D-GalN)與脂多糖(LPS) 購自美國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ACLF小鼠模型建立 將40只小鼠按隨機數字表法分為四組，每組10只。本研究采用CCl4聯合D-GalN和LPS建立ACLF模型[5-6]。正常組(CON組)作為正常對照組進行觀察。模型組(MOD組)小鼠按5 ml/kg腹腔注射20% CCl4(橄欖油稀釋) ，2次/周，共12周，10 d后給予一次性腹腔聯合注射(LPS 0.5 mg/kg、D-Gal 400 mg/kg)，建立ACLF模型，48 h后處死。糞菌移植組(FMT組)小鼠造模同MOD組，在第12周予以制備的正常組(CON組)小鼠糞菌液200 μl/只灌胃，持續3 d。模型小鼠糞菌移植組(ANFMT組)小鼠，在第12周予以制備的模型組(MOD組)小鼠糞菌液200 μl/只灌胃，持續3 d外。CON組小鼠給予腹腔注射同等劑量的橄欖油、生理鹽水，同等劑量生理鹽水灌胃。MOD組予以同等劑量生理鹽水灌胃。4組小鼠同時處死。

1.3.2 標本采集與糞菌液制作 糞便標本采集采用刺激小鼠肛門的方法收集新鮮排出的小鼠糞便裝于EP管中，裝好的標本迅速轉移至-80 ℃冰箱凍存。稱重后用無水乙醚麻醉，眼球取血放入采血管(含有肝素鋰)，1500 r/min離心5 min，取上清液，-80 ℃冰箱保存。眼球取血后的小鼠頸椎脫臼處死后解剖，取出肝臟，每只小鼠在肝右葉同一位置切取2塊0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm大小肝組織，放進10%福爾馬林溶液，用于病理檢測。

參照相關文獻制備糞菌液[7-8]，具體步驟如下：(1)分別選取CON組和MOD組小鼠糞便；(2)稀釋，糞便稱重后放于攪拌器中，加入5倍糞便重量的無菌生理鹽水進行攪拌混勻；(3)過濾,將糞便混懸液先后經過直徑約1、0.5、0.25 mm的自制滅菌不銹鋼濾網過濾；(4)離心,將懸液用15 ml離心管分裝置于離心機中(2000 r/min、5 min)，棄上清液；(5)洗滌,將菌液加生理鹽水至原懸液的量并搖勻，再次離心(2000 r/min、5 min)重復3次；(6)凍存。按照50 ml菌液加甘油(100%)5 ml的比例搖勻，分裝于2 ml凍存管中，放入-80 ℃冰箱。

1.4 各項指標檢測 肝功能指標：采用全自動生化儀檢測ALT、AST水平。病理HE染色：肝組織在10%福爾馬林溶液中固定1 d后取出，進行梯度濃度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，并包埋在石蠟里，行組織切片及HE染色，最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照、保存。糞便腸道菌群檢測：糞便樣品按照試劑盒說明書提取DNA，將DNA樣品在Illumina NovaSeq平臺對小鼠糞便腸道菌群進行高通量測序，獲得16SrDNA數據。構建類OTU( Operational Taxonomic Units)表，獲得最終的feature特征表以及特征序列，進一步進行Venn圖、α多樣性分析、β多樣性分析、觀察在門、屬水平相對豐度較高的物種并進行差異分析等。

1.5 倫理學審查 本研究方案經由蘇州大學實驗動物倫理委員會審批，批號：SUDA20201208A03，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 小鼠體質量和肝功能的變化 4組小鼠體質量變化如圖1所示，在進行糞菌灌胃3 d內，ANFMT組與FMT組小鼠體質量均下降。與CON組相比，MOD組小鼠體質量顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。MOD組與FMT組在CCl4腹腔注射及灌糞菌液期間均未出現小鼠死亡，在末次聯合注射LPS與D-GalN，MOD組死亡4只，FMT組死亡2只，2組病死率差異無統計學意義(P>0.05)。與CON組相比，ANFMT組、MOD組、FMT組AST水平均顯著升高(P值均<0.05)，MOD組ALT水平顯著升高(P<0.05)。與MOD組相比，FMT組AST、ALT均顯著下降(P<0.05)(表1)。

表1 4組小鼠體質量與肝功能水平比較

圖1 4組小鼠體質量變化

2.2 小鼠肝組織病理結果 如圖2所示，CON組小鼠肝小葉形態結構正常，肝細胞無變性、壞死，無炎性細胞浸潤；MOD組小鼠肝小葉結構嚴重破壞，排列紊亂，肝細胞大片狀壞死并伴炎性細胞浸潤；與CON組相比，ANFMT組肝細胞腫脹，輕微氣球樣變，炎性浸潤增多；FMT組彌漫性肝細胞腫脹，明顯氣球樣變、壞死輕于MOD組。

注：a，CON組；b，ANFMT組；c，MOD組；d，FMT組。圖2 各組小鼠肝組織病理(HE染色，×200)

2.3 測序結果質量分析

2.3.1 feature分布Venn圖 基于各組樣本的OTU數量繪制了可直觀顯示差異的Venn圖。CON組有525個獨有的OTU，ANFMT組有718個獨有的OTU，MOD組有1360個獨有的OTU，FMT組有991個獨有的OTU(圖3a)。與CON組相比，MOD組有1701個獨有的OTU，ANFMT組有992個獨有的OTU，FMT組有1331個獨有的OTU(圖3b～d)。

2.3.2 α多樣性分析 各樣本稀釋曲線均趨于平坦(圖4)，表明本實驗取樣量合理且物種組成豐富度高，可進一步分析。α多樣性分析中observed_OTUs指數(χ2=1.42，P=0.70)、Shannon指數(χ2=1.71，P=0.63)、Simpson指數(χ2=1.25，P=0.74)在各組差異無明顯統計學意義。

2.3.3 β多樣性分析 主成分分析(PCA)表明，與CON組相比，MOD組、FMT組、ANFMT組大鼠腸道菌群組成結構均發生顯著變化(P<0.01)(圖5)。基于Weighted_UniFrac NMDS分析顯示，4組腸道菌群存在差異(P<0.01)(圖6)。主坐標分析(PCoA分析)顯示，4組各樣本間距離較大，差異有統計學意義(P<0.01)(圖7)。基于Weighted_Unifrac anosiom相似性分析：R=0.286，P=0.001；基于Weighted_Unifrac adonis多元分析：R2=0.263，P=0.02，表明組間差異大于組內差異，4個不同分組樣品存在差異，可信度高。

注： a，4組比較；b，CON組 vs ANFMT組；c，CON組 vs MOD組；d，CON組 vs FMT組。

圖4 各組糞便菌群稀釋曲線圖

圖5 4組腸道菌群PCA分析

圖6 4組腸道菌群NMDS分析

注： a，基于unweighted unifrac分析；b，基于 weighted unifrac分析。圖7 4組腸道菌群PCoA分析

2.3.4 小鼠腸道菌群物種組成分析

2.3.4.1 門水平腸道菌群結構分析 基于門水平樣本物種組成結構和差異性聚類分析發現，小鼠糞便菌群組成以擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Fimicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)為主，Bacteroidetes和Fimicutes為主要優勢菌群(圖8a)。在柱狀圖的基礎上，還可以根據樣品物種組成距離對樣品進行聚類分析，采用Bray-Curtis距離，ANFMT組各菌門豐度雖與CON組相近，但菌門平均豐度上升或下降與MOD組相似；FMT組菌群較MOD組有一定程度的恢復(圖8b)。對同一生物學重復組內取均值進行熱圖繪制(圖9)，門水平差異檢驗顯示，與CON組相比，MOD組小鼠Verrucomicrobia上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與CON組相比，ANFMT組小鼠未分類(unclassified)升高，Patescibacteria、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)下降，差異均有統計學意義(P值均<0.05)；與MOD組相比，FMT組小鼠厚壁菌門(Fimicutes)下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

注： a，門水平柱狀圖; b，樣品聚類分析圖。圖8 四組菌群門水平分布情況

注：與CON組相比，*P<0.05；與MOD組相比，#P<0.05；藍色表示豐度低，紅色表示豐度高。

2.3.4.2 屬水平腸道菌群結構分析 各組菌群菌屬相對豐度上存在明顯差異，且優勢菌群發生變化。CON組中Muribaculaceae_unclassified、Dubosiella在腸道菌群中占比最高，MOD組中，Muribaculaceae_unclassified、鏈球菌屬(Streptococcus)阿克曼菌屬(Akkermansia)在腸道菌群中占比最高(圖10a)。聚類分析顯示，ANFMT組在菌屬水平豐度雖與CON組相近，各菌屬豐度變化較MOD組菌屬變化相似；FMT組菌群與MOD組比有一定程度的恢復(圖10b)。對同一生物學重復組內取均值進行熱圖繪制(圖11)，屬水平差異檢驗顯示，與CON組相比，ANFMT組小鼠unclassified、Faecalibaculum上升，Muribaculum、Candidatus_Saccharimonas、理研菌屬(Rikenella)、Odoribacter、Mucispirillum、Lachnospiraceae_unclassified下降，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。與CON組相比，MOD組小鼠Akkermansia屬、Erysipelatoclostridium上升，Dubosiella、Duncaniella下降，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。與MOD組相比，FMT組小鼠Paramuribaculum、嗜膽菌屬(Bilophila)上升，Rikenella、Absiella下降，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

2.3.5 各組菌群差異 LEfSe(LDA Effect Size)差異分析旨在找到不同組間豐度上有顯著性差異的物種。根據LDA值大小(LDA>4)，在門屬水平上，MOD組中Fimicutes占優勢；ANFMT組中Dubosiella占優勢，CON組中奈瑟菌屬(Neisseria)占優勢(圖12)。

注： a，屬水平柱狀圖；b，樣品聚類分析圖。圖10 四組菌群屬水平分布情況

注：與CON組相比，*P<0.05；與MOD組相比，#P<0.05。

3 討論

腸道微生物群定居于人類腸道，腸道細菌數量超過100萬億，其復雜基因組比人類基因組多150倍[9]。腸肝軸為腸道與肝臟之間形成解剖和功能上的緊密聯系。一方面細菌或代謝物進入門靜脈血循環，與免疫細胞相互作用，到達肝臟微循環，與非實質性和實質性肝細胞相互作用。另一方面，肝臟還分泌膽汁酸，膽汁酸反過來改變腸道微生物群，同時也作為肝臟、腸道微生物群和腸道之間的信號分子[10]。

目前，ACLF仍有較高的發病率與病死率。肝硬化患者一旦發生急性失代償，15%的住院患者將進一步發展為ACLF，其中40%將在90天內死亡[11]。Qin等[10]認為健康對照者相比，肝硬化患者腸道微生物擬桿菌門與厚壁菌門水平降低，而鏈球菌屬和韋榮球菌屬升高，微生物群的變化是隨著肝硬化的發展而發生的。最近Bajaj等[12]的研究證實了腸道微生物與肝硬化之間的聯系，該研究表明，在1例嚴重肝硬化患者肝移植后，腸道微生物的多樣性和共生性顯著提高。在另一篇文獻中，Bajaj等[13]研究認為通過飲食獲得的不同腸道微生物與肝硬化的進展和住院風險有關。Chen等[2]發現腸道微生物組成變化與肝病的嚴重程度相關，與ACLF患者發病前相比，ACLF患者擬桿菌門、瘤胃菌科、紫單胞菌科、毛螺旋菌科水平下降，而厚壁菌門水平上升。有足夠的證據[14-16]表明，微生物群的變化會影響肝病的進展。

由于人和鼠存在的異源性，本研究選取小鼠糞便作為糞菌群供體，而非人類糞便。結果顯示，在進行糞菌移植時，FMT組與ANFMT組小鼠體質量均出現下降，可能與菌群定植反應有關；與CON組小鼠相比，MOD組小鼠體質量明顯下降，肝細胞大片壞死，造模成功。FMT組小鼠腸道菌群改善，體質量恢復，ALT、AST明顯降低，肝細胞壞死減輕，從而進一步說明了改善腸道菌群對ACLF小鼠具有保護作用。ANFMT組小鼠AST明顯升高，肝細胞輕微氣球樣變和炎性細胞浸潤，說明菌群紊亂導致肝損傷；而同時MOD組小鼠肝損傷引起菌群改變，可見肝臟與腸道菌群互為因果。

Zhang等[17]研究發現因給予大腸桿菌、鼠傷寒上門氏菌和腸球菌出現菌群失調從而導致肝硬化大鼠細菌易位和AST水平顯著增高。LPS通過CD14、Toll-樣受體4、核因子κB和TNFα信號通路以及其他信號通路誘導肝細胞凋亡[18]。然而，LPS主要通過Kupffer細胞在肝臟中清除，因此肝衰竭直接導致的Kupffer細胞功能障礙可能導致血漿LPS異常。Kupffer細胞功能狀態與肝損傷程度之間存在相關性[19]。 當肝功能受損時，持續的免疫激活、炎癥、Kupffer細胞功能受損和不受控制的內毒素血癥可引起活性氧(ROS)刺激[20-21]。由于內毒素血癥、免疫功能紊亂和Toll樣受體4介導的炎癥，導致腸道細菌過度生長[22]。總之，腸道菌群失調可通過以下機制加速ACLF的進展[23-24]：(1)腸道通透性增加和腸道細菌易位增強；(2)菌群失調的微生物促進炎癥反應，導致了黏膜損傷。雖然腸道微生物在ACLF的發病機制和并發癥中的作用尚不完全清楚，但這些發現為通過調節腸道微生物來治療ACLF提供了希望。

綜上所述，ACLF小鼠會出現腸道菌群失調，而FMT可以調節腸道菌群，減輕肝損傷，對ACLF小鼠具有保護作用。干擾正常小鼠的腸道微生態后，菌群失調會進一步導致肝損傷。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：高安負責課題設計，實施研究，資料分析，撰寫論文；徐玉靜、陸圣威參與收集及分析數據；孫蔚負責擬定寫作思路，修改論文；甘建和負責指導撰寫文章并最后定稿。