表沒食子兒茶素沒食子酸酯穩定性研究

郝 靜，楊太琴，2，+，王 晗，2，汪 旭，2，倪 娟，2，*

(1.云南師范大學生命科學學院，云南昆明650500;2.云南師范大學生物能源持續開發與利用教育部工程研究中心，云南昆明650500)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(－)－ epigallocatechin－3－gallate，EGCG］，是兒茶素中含量最高活性最強的成分，也是綠茶利好人體健康的主要承擔者［1－2］。兒茶素的結構特征是B－環上有二個或三個羥基基團和A－環上的5，7－二羥基基團，因此具有抗氧化活性。EGCG除上述兩個環上的羥基外，還在D－環上帶有三個羥基，在四種主要的兒茶素中，其抗氧化活性最強［3－4］。EGCG不僅可以直接清除胞內活性氧/氮離子，還能螯合幾種具有強正電荷的金屬離子(Fe3+、Al3+和Gu2+);其可使鐵離子失活，抑制超氧化物驅動的芬頓反應(Fenton reaction);抑制H2O2形成和脂質過氧化。因此，大多研究認為EGCG對人體健康的利好效應源于其卓越的抗氧化能力［5］。

然而，由于EGCG特殊的化學結構特征，穩定性較差，可發生自動氧化和異構反應，根據所處條件(EGCG濃度、pH、溫度和含氧量等)其反應取向不同。當EGCG自動氧化形成多聚物時，可能產生如H2O2一類的活性氧(reactive oxygen species，ROS)［6］，表現出促氧化活性。有研究發現，50μmol/L EGCG在無細胞的McCoy’s 5A培養基中120 min，培養基中的H2O2達到峰值25μmol/L。用相同的條件處理HT－29細胞30 min后培養體系中的H2O2水平達到最高水平10μmol/L［7］。在活體中，也觀察到了EGCG的促氧化效應，用高劑量的EGCG喂食小鼠，出現劑量依賴的肝臟毒性［8］。但EGCG的促氧化效應在不同的細胞和動物模型中并沒有得到一致的結論。Sheng等［9］發現200μmol/L的H2O2能顯著誘導正常人心臟成肌細胞H9c2凋亡，而EGCG可抑制H2O2介導的H9c2凋亡，用EGCG單獨處理H9c2時并未觀察到胞內外的H2O2水平的變化。

因此，本文解析EGCG氧化聚合的環境條件，及其穩定性變化對受試細胞氧化還原平衡的影響，為進一步探討EGCG在細胞培養體系及活體中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人正常結腸上皮NCM460細胞 購自中科院昆明動物所細胞庫;EGCG粉末 購自sigma公司;過氧化氫檢測試劑盒(S0038)購自上海碧云天公司。

MCO－5AC培養箱 SANYO;318C酶標儀 上海三科儀器;NanoPhotometer N60分光光度計 IMPLEN;VANOX－S顯微鏡 OLYPUS。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑配制

1.2.1.1 EGCG溶液 0.15 g EGCG粉末融入10 mL的三蒸水中攪拌均勻配制成32 mmol/L的EGCG溶液，在超凈工作臺利用0.2μm針頭濾器進行無菌過濾。待實驗開始前將EGCG溶液儲存液稀釋至如表1所需濃度。

1.2.1.2 細胞培養基 RPMI1640或DMEM培養液Gibco，含10%胎牛血清Gibco;0.1%雙抗(10萬單位/mL)Gibco;1%L－谷氨酰胺(200 mmol/L)Gibco。

1.2.1.3 其他 細胞磷酸緩沖液(PBS)Gibco;0.4%臺盼藍Solarbio，0.25%胰蛋白酶Gibco。

1.2.2 影響EGCG氧化聚合的環境因素分析

1.2.2.1 溶液環境對EGCG聚合的影響 實驗選擇了H2O、RPMI1640、DMEM(pH=7)三種溶液體系，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培養箱恒溫反應24 h后，吸取三個重復的150μL溶液置于96孔板中，檢測578 nm的OD值，以確定溶液體系對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.2 溫度環境對EGCG聚合的影響 實驗以RPMI1640(pH=7)為溶液體系，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置于37℃培養箱和74℃的水浴鍋中恒溫反應24 h后，吸取三個重復的150μL溶液置于96孔板中，檢測578 nm的OD值，以確定溫度對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.3 時間對EGCG聚合的影響 實驗以RPMI1640(pH=7)為溶液體系，加入320μmol/L的EGCG，置于37℃培養箱恒溫反應3、6、12、24 h后，各組吸取三個重復的150μL溶液置于96孔板中，檢測578 nm的OD值，以確定時間對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.2.4 pH對EGCG聚合的影響 實驗選用RPMI1640和H2O為兩種溶液體系，分別設置不同的pH(p H=5和9)，加入不同濃度的EGCG(0、20、80、320μmol/L)，分別置于37℃培養箱中恒溫處理24 h后，各組吸取三個重復的150μL溶液置于96孔板中，檢測578 nm的OD值，以確定pH對EGCG氧化聚合的影響。

1.2.3 EGCG在培養系統中對NCM460細胞的胞內、外H2O2濃度影響 接種6個含NCM460的6孔培養板，待細胞貼壁生長后，更換含有不同濃度EGCG(0、20、40、80μmol/L)的RPMI1640培養液，每個6孔板培養時間分別為1、2、3、6、12、24 h，在對應的時間節點先取各孔上層培養液50μL，用于胞外H2O2濃度檢測。之后，棄去含EGCG培養基，胰酶消化后用1 mL RPMI1640培養基吹打混勻形成細胞懸液，計數，吸取5×105個細胞，用于胞內H2O2濃度檢測。

1.2.4 H2O2濃度檢測 按照過氧化氫檢測試劑盒操作步驟，檢測不同濃度EGCG處理各時間點的培養上清及細胞內H2O2濃度。

表1 不同濃度EGCG溶液的配制Table 1 Preparation different concentrations of EGCG solution

1.3 統計學分析

實驗均重復三次，對數據進行整理歸納，利用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析，采用GrahPad Prism 5制圖軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 環境因素對EGCG氧化聚合的影響

2.1.1 溶液體系對EGCG氧化聚合的影響 實驗設置了H2O、RPMI1640、DMEM(pH=7)3種溶液體系，比對不同的溶液對EGCG氧化聚合的影響。如圖1所示，在相同EGCG濃度下，RPMI1640、DMEM兩種培養基的OD578值極顯著高于H2O(P＜0.001);對比兩種培養基，DMEM的OD578值高于RPMI1640，即三種溶液體系促進EGCG氧化聚合率的排序為:DMEM＞RPMI1640＞H2O。

圖1 EGCG在不同溶液環境中OD值比較Fig.1 Comparison of OD value of EGCG in different solution environments

2.1.2 溫度對EGCG氧化聚合的影響 實驗設置了37和74℃研究溫度對EGCG氧化聚合率的影響。如圖2所示，在以RPMI1640為溶液體系下，除最高EGCG濃度320μmol/L外，各濃度組74℃的氧化聚合率均顯著高于37℃(P＜0.05)，即高溫促進EGCG的氧化聚合。

圖2 EGCG在不同溫度條件下OD值比較Fig.2 Comparison of OD value of EGCG in different temperatures

2.1.3 EGCG濃度對自身氧化聚合的影響 不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)分別以H2O、RPMI1640、DMEM(pH=7)三種溶液體系，反應3、6、12、24 h。結果顯示，以H2O為溶液的各EGCG濃度組間無顯著差異(圖3i，j，k，l);以RPMI1640和DMEM為溶液體系的3 h組，各濃度間也無顯著差異(圖3a，e)，其余各組均隨著EGCG濃度的升高，OD578顯著上升(P＜0.05)(圖3b，c，d，f，g，h)，即高濃度促進EGCG的氧化聚合。

2.1.4 反應時間對EGCG氧化聚合的影響 實驗設置了4個反應時間，探討時間對EGCG氧化聚合的影響。通過EGCG濃度及溶液環境對其自動氧化影響的結果顯示，培養液及高濃度的EGCG促進其氧化聚合，因此，對比了320μmol/L的EGCG在RPMI1640培養基中各時間點OD578的變化。如圖4顯示，12和24 h的OD578極顯著高于3 h(P＜0.001)，即在高濃度下，隨著作用時間延長，EGCG氧化聚合率顯著增加。

2.1.5 pH對EGCG氧化聚合的影響 實驗設置了pH=5和9探討pH對EGCG氧化聚合的影響，選用RPMI1640和H2O兩種溶液條件，37℃時分別比較了不同pH條件下的OD值變化。如圖5a所示，以RPMI1640作為溶液環境，各濃度下兩種p H的OD578均有極顯著差異(P＜0.001)，pH=5時各濃度組OD578變化不顯著(P＞0.05);p H=9時OD578隨著EGCG濃度的升高顯著增大(P＜0.05)。當以H2O作為溶液環境，p H=5各濃度OD57值均極顯著低于pH=9的OD578值(P＜0.001)，如圖5b，綜合各組結果，堿性環境較酸性環境促進EGCG的氧化聚合。

2.2 EGCG穩定性的改變對NCM460細胞的胞內、外H2 O2濃度影響

2.2.1 細胞內H2O2水平的檢測 對比不同處理時間點發現，胞內H2O2濃度呈現先上升后下降的趨勢;與對照組0μmol/L相比，H2O2濃度1 h內出現了短暫增高，其中80μmol/L組極顯著增高(P＜0.001)(圖6a)，處理3 h后，與對照組相比高濃度EGCG中的H2O2濃度出現顯著下降(P＜0.05)(圖6c)，這種現象在處理12 h后更顯著(P＜0.001)(圖6d)。

2.2.2 胞外H2O2水平的檢測 結果顯示，隨著處理時間的延長，培養體系中H2O2濃度呈現上升趨勢;對比相同時間不同濃度組發現，處理2、3、6、12 h后，20、40、80μmol/L的處理體系H2O2濃度顯著高于對照組(P＜0.05)，即培養體系中的H2O2濃度隨時間延長和EGCG濃度的增加而顯著上升，處理24 h后胞外的H2O2水平出現明顯降低，見圖7。

3 討論

EGCG的多種生物活性已在細胞培養模型中得到證實，其中最顯著的為抗氧化、抗炎和抗癌作用［2，10－12］，這表明EGCG很可能成為因ROS增加和/或細胞抗氧化能力不足引發的退行性疾病的臨床藥物。然而，EGCG在相應動物實驗中的結果是存在爭議的［13－14］。依據EGCG結構特征，其在細胞培養物中和整個生物體中的活性不一致可能歸因于EGCG分子的穩定性不足，EGCG不受控的降解或聚合［15－16］，不僅會導致體外研究結論不準確，還會限制EGCG在體內的生物利用度。

圖3 不同濃度EGCG在各溶液環境及反應時間下OD值比較Fig.3 Comparison of OD values of different concentrations of EGCG in each solution and reaction time

圖4 320μmol/L的EGCG在不同反應時間下OD值比較Fig.4 Comparison of OD value of 320μmol/L EGCG in different time

本實驗發現不同的溶液環境對EGCG的氧化聚合有較明顯影響，在DMEM培養液中EGCG的聚合效率更高，而H2O的影響較小，這與Krupkova等［17］的研究結果吻合;高溫促進了EGCG的自動氧化，Krupkova等［17］也證實低溫可以保持EGCG的穩定性;不同EGCG濃度下EGCG的氧化聚合程度不同，高濃度促進EGCG的聚合，同時，隨著反應時間的增長，EGCG的聚合物增多;溶液pH對EGCG的穩定性也有較明顯影響，EGCG在酸性環境中更加穩定(pH＜6)，這與相關研究相符［17－18］。由此可見，溶液環境、溫度、反應時間、EGCG濃度和溶液pH等因素均會影響EGCG的穩定性，在相關實驗條件下應給予考慮。已有研究證實，環境是確定EGCG抗淀粉樣蛋白功效的關鍵因素［19］，因此，解析EGCG穩定性的環境條件對于進一步研究其在機體中發揮功效的機制有重要意義。

圖5 EGCG在不同pH條件下以RPMI1640為溶液環境(a)和H2 O為溶液環境(b)的OD值比較Fig.5 Comparison of OD values with RPMI1640 as solution environment(a)and H2 O as solution environment(b)under different pH conditions

圖6 不同濃度EGCG處理后NCM460胞內過氧化氫濃度變化圖Fig.6 Changes of intracellular hydrogen peroxide concentration in NCM460 treated with different concentrations of EGCG

圖7 不同濃度EGCG處理下NCM460胞外過氧化氫濃度變化圖Fig.7 Changes of extracellular hydrogen peroxide concentration in NCM460 treated with different concentrations of EGCG

在正常培養細胞體系中探討了EGCG的穩定性對其抗氧化能力的影響，發現胞外H2O2水平在時間和濃度效應上與對照組相比呈上升趨勢，而胞內出現先上升后下降的趨勢。研究分析，EGCG在培養體系中會發現氧化聚合反應，生成H2O2;隨后，H2O2進入細胞，使胞內H2O2水平迅速上升，給細胞造成氧化脅迫［20］，激活胞內的抗氧化系統應對脅迫［21－22］，隨著抗氧化酶系的積極響應，胞內H2O2水平出現短暫上升然后開始下降，最終表現為EGCG處理后，細胞內H2O2濃度低于未處理細胞，表現為抗氧化效應，特別是20μmol/L組，這一過程可能是EGCG發揮生物活性，特別是在抗增殖和癌癥治療中的潛在作用［23］。如20μmol/L的EGCG是其通過預警響應發揮抗氧化活性的最適濃度，隨著EGCG濃度的升高，氧化聚合反應產生的H2O2水平超過細胞氧化應激范圍，可能對細胞造成氧化損傷，詳細分子機制有待進一步驗證。

4 結論

RPMI1640和DMEM培養基較H2O更促進EGCG的氧化聚合，低溫低EGCG濃度及酸性條件利于EGCG的穩定，同時EGCG的氧化聚合隨反應時間延長而加劇。在含有細胞的培養體系中，EGCG也會發生自動氧化聚合并產生H2O2，導致細胞內外的H2O2濃度升高，但胞內H2O2濃度呈現先上升后下降的趨勢。研究結果提示，一定濃度的EGCG在培養細胞中可能通過氧化聚合產生H2O2，形成氧化脅迫，進而激活細胞內抗氧化防御系統，使細胞內H2O2濃度隨后降低，表現出抗氧化效應。