發光桿菌產幾丁質酶的工藝優化

陳立功，吳家葳，張 冉，張慶芳，遲乃玉，王曉輝，*

(1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116600;2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連116600)

幾丁質(chitin)又稱甲殼質、殼多糖，為天然生物聚合物，是海洋中含量最豐富的可再生資源，每年形成量超過1011噸［1－3］。海洋幾丁質主要通過海洋低溫微生物分泌的低溫幾丁質酶完成降解，參與海洋物質循環［4］。幾丁質廣泛存在于動植物及微生物中，在蝦蟹殼中的含量極高，主要起支撐和保護作用［5－7］。幾丁質水解后生成的幾丁寡糖、幾丁單糖及其衍生物，具有良好的組織兼容性及免疫抗菌作用，具有重要應用價值［8－10］。粉狀晶體幾丁質為白色或淡黃色固體，性質穩定，不溶于水，自然狀態下不易降解。每年有超過8萬噸幾丁質被視為廢物丟棄，既污染了環境，又造成了資源浪費［11－13］。

幾丁質酶(chitinase，EC 3.2.1.14)是專一降解幾丁質的一類糖苷水解酶的總稱，能夠完成幾丁質到幾丁寡糖及幾丁單糖的轉化［14－15］。幾丁質酶通過對幾丁質的降解作用，可對病原真菌及昆蟲的生長造成有效的抑制和殺傷［16－18］。目前對幾丁質酶的研究，大多集中在微生物來源的幾丁質酶上，包括假單胞菌、鏈霉菌和芽孢桿菌等［19－20］。已研究的幾丁質酶主要集中于中高溫幾丁質酶，隨著幾丁質酶在生產生活中的應用，人們發現中高溫幾丁質酶雖然高溫下降解效率較高，但穩定性差，且高溫的降解條件對設備要求較高，增加了生產成本，已經不能滿足工業化生產的需要［21－22］。低溫酶在較低溫度下有較高的降解效率且穩定性高，發現、發掘、開發低溫幾丁質酶日漸成為研究熱點［23］。目前低溫幾丁質酶的主要來源為低溫微生物(cold－adapted microorganism)，根據其生長繁殖溫度可分為嗜冷菌(psychrophile)和耐冷菌(psychrotroph)，0℃是否能生長繁殖，最適生長溫度是否低于15℃是二者劃分的主要依據，嗜冷菌比耐冷菌更耐寒［24］。

海洋中有豐富的微生物資源未被開發利用，其天然的低溫環境和平均含鹽量3.5%的高鹽環境，是低溫微生物的天堂，其內生活的微生物大多具有嗜冷或耐冷特性，并對高鹽環境具有一定的耐受性［15－26］。海洋微生物所產生的酶，往往在低溫下仍具有較高催化效率［27］。為滿足工業生產需求，解決幾丁質酶在低溫下降解效率不高的問題，越來越多的學者聚焦于海洋，期待從海洋篩選到高產低溫幾丁質酶的菌株，且已發現假單胞菌屬(Pseudomonas sp.BK1)和節桿菌屬(Arthrobacter sp.TAD20)等多種可產低溫幾丁質酶的微生物，但酶活力均較低［28－30］。目前，國內外研究中未見發光桿菌屬菌株產低溫幾丁質酶的發酵條件優化的相關報道。

本文從海泥中篩選到高產幾丁質酶的發光桿菌，命名為Photobacterium sp.LG－1，前期對其進行了形態學和分子生物學鑒定及單因素發酵條件優化，單因素優化后菌株產幾丁質酶活為4.57 U/mL［31］。為了滿足幾丁質酶工業應用的大量需求，提高幾丁質酶的產量，本研究利用Plackett－Burman、Box－Behnken實驗對LG－1產低溫幾丁質酶的發酵條件進行進一步優化，提高幾丁質酶的產量及活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發光桿菌(Photobacterium sp.LG－1)篩選自中國遼寧大連渤海海域近海底泥5～100 m(123°391＇E，39°6972＇N);發酵培養基 膠體幾丁質12.0 g/L、酵母膏6.0 g/L，原地海水，自然p H;幾丁質 博奧拓達(北京)公司;酵母膏 奧博星(北京)生物公司;瓊脂粉 北京索萊寶生物科技有限公司。

LTI－700低溫恒溫培養箱 上海愛朗儀器有限公司;CRY－2112恒溫搖床 上海茸研儀器有限公司;Thermo Multiskan1510酶標儀 芬蘭Labsystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠體幾丁質制備 根據王曉輝等［16］的方法進行1%膠體幾丁質的制備:取10 g幾丁質置于研缽，緩慢加入100 mL濃鹽酸并不斷攪拌1 h，保鮮膜封口后于冰箱4℃下過夜。大量超純水反復洗至中性，離心后用0.1 moL/L磷酸緩沖液定容為1 L。

1.2.2 酶活測定 取0.5 mL 1%膠體幾丁質與0.5 mL粗酶液混合，25℃下水浴保溫15 min，10000 r/min離心5 min，取上清200μL煮沸5 min，冷卻后，加入200μL DNS溶液煮沸5 min，冷卻后加入600μL超純水，10000 r/min離心10 min，取200μL于96空板中測定OD520，三組平行實驗。酶活單位定義(U):在上述條件下，催化產生lμmol N－乙酰－D－氨基葡萄糖所需的酶量。

1.2.3 菌懸液的制備及產酶發酵工藝 挑取單菌落至5 mL發酵培養基，15℃220 r/min搖床振蕩培養至OD6000.5～0.6，作為發酵優化實驗種子液。種子液接種至發酵培養基，培養96 h，將發酵液6000 r/min離心去沉淀，得粗酶液，測定酶活性。

1.2.4 Plackett－Burman實驗 為確定影響菌株LG－1幾丁質酶活的三個主要因素，根據前期單因素優化結果:膠體幾丁質12.0 g/L、酵母膏6.0 g/L、發酵溫度15℃、初始p H7.0、轉速為220 r/min、裝液量75 mL/250 mL、接種量1%、發酵時間96 h，以軟件Minitab 15對膠體幾丁質濃度、酵母膏濃度、轉速、發酵溫度、裝液量、接種量(種子液菌體濃度OD6000.5～0.6)、初始p H、發酵時間8個因素設計N=12的8因素2水平Placket－Burman實驗。3組平行試驗。各因素對應因子代碼如表1所示。

表1 Plackett－Burman實驗設計各因素水平及分析Table 1 Levels of the variables and statistical analysis of Plackett－Burman design

1.2.5 最陡爬坡實驗 以三個影響酶活的主要因素設計最陡爬坡實驗，以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，3組平行試驗。

1.2.6 Box－Behnken實驗設計 根據Plackett－Burman實驗及最陡爬坡實驗結果，以軟件Minitab 15設計N=17的3因素3水平的Box－Behnken實驗，自變量為發酵溫度X1、發酵時間X2、酵母膏X3。3組平行試驗并進行數據分析，如表2所示。

1.3 數據處理

運用Minitab 15軟件通過響應面分析法對實驗結果進行優化分析，得到最優結果后，運用Minitab 15軟件對預測值進行驗證。所有實驗均重復三次。

2 結果與分析

2.1 發酵實驗的Plackett－Burman設計

根據表1影響酶活的各因素及水平，利用Minitab 15軟件設計N=12的P－B實驗，發酵后離心發酵液，取上清進行酶活檢測。3組平行實驗，結果如表3所示。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

表3 Plackett－Burman實驗設計及結果Table 3 Experimental design and result of Plackett－Burman influencing

P－B實驗結果(表4)顯示，P值＜0.05的因素有膠體幾丁質、酵母膏、發酵溫度、裝液量、接種量及發酵時間，以上因素對菌株LG－1產幾丁質酶活性的影響均＞95%，達到顯著水平。其它影響因素選值為單因素實驗優化結果。其中發酵溫度、發酵時間和酵母膏添加量三個因素影響效果最為顯著。因此以這三個因素進行響應面試驗。

表4 P－B實驗設計各因素主效應分析結果Table 4 Results of the variables and effect in P－B design

2.2 最陡爬坡試驗

由最陡爬坡實驗確定中心點結果(表5)可知，3組平行實驗得到最佳因子組為第2組。最佳因子組條件為:發酵溫度(X1)15℃，發酵時間(X2)96 h，酵母膏添加量(X3)6 g/L。

表5 最陡爬坡實驗設計及結果Table 5 Experimental design and result of steepest ascent

2.3 響應面實驗優化培養條件

2.3.1 Box－Behnken實驗 根據最陡爬坡實驗結果，以X1(發酵溫度)、X2(發酵時間)、X3(酵母膏)為自變量設計N=17的3因素3水平的Box－Behnken實驗。3組平行實驗結果如表6所示。

表6 Box－Behnken設計及結果Table 6 Design and results of Box－Behnken design

2.3.2 回歸方程的建立及其顯著性 Box－Behnken實驗結果經Minitab 15軟件進行分析確定影響菌株LG－1產低溫幾丁質酶活性的二次回歸方程:Y=4.19+0.46X1+0.11X2+0.10X3+0.45X1X2－0.44X1X3

該方程進行回歸系數顯著性檢測和方差分析結果(見表7)顯示，該回歸模型的P值＜0.01，而失擬項的P值＞0.05，證明模型建立成功。其自變量X2，X3對響應值的影響顯著(P＜0.05)，自變量X1、對響應值影響極顯著(P＜影響不顯著(P＞0.05)。回歸系數R2=98.85%大于90%，校正決定系數表明模型相關度很好。此模型可用來分析和預測實驗結果。

2.3.3 響應面分析及最優條件確定 根據二次多項式模型利用Minitab 15軟件繪出響應面分析圖(圖1～圖3)。由響應面圖可以看出:發酵溫度X1、發酵時間X2、酵母膏X3三個因素兩兩之間存在交互作用。當發酵溫度X1、發酵時間X2、酵母膏X3分別為20℃，120 h，4.42 g/L時達到最佳，幾丁質酶活的理論值為5.10 U/mL。

表7 回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of the quadratic model

圖1 發酵溫度與發酵時間對酶活的交互影響Fig.1 Response surface plot of the effects of fermentation temperature and fermentation time on the enzyme activity

圖2 發酵溫度與酵母膏對酶活的交互影響Fig.2 Response surface plot of the effects of fermentation temperature andyeast extract on the enzyme activity

在考慮到實際實驗操作的基礎上，對模型的準確性進行驗證，將軟件分析得出的最佳發酵條件進行調整:膠體幾丁質濃度12.0 g/L、酵母膏濃度4.5 g/L、發酵溫度20℃、初始p H7.0、轉速為220 r/min、裝液量75 mL/250 mL、接種量1%、發酵時間120 h，3次平行實驗所得幾丁質酶的平均酶活為5.10 U/mL，與理論值相同，表明響應面法所得結果準確可靠。與優化前酶活4.57 U/mL相比，響應面優化后的酶活提高了11.50%。

圖3 發酵時間與酵母膏對酶活的交互影響Fig.3 Response surface plot of the effects of fermentation timeandyeast extract on the enzyme activity

3 結論與討論

根據嗜冷菌和耐冷菌的劃分依據［24］，發光桿菌Photobacterium sp.LG－1最適生長產酶溫度為20℃，高于15℃，初步判斷菌株LG－1為耐冷菌。本研究在前期單因素優化的基礎上對菌株LG－1的發酵產酶條件進行了響應面優化，完成了發酵產酶條件的系統性優化過程。確定了發酵溫度、發酵時間和酵母膏是影響菌株Photobacterium sp.LG－1產酶的重要因素。最陡爬坡實驗及響應面實驗聯合優化，確定了三個最顯著影響因素的最佳培養條件為發酵溫度20℃、發酵時間120 h和酵母膏濃度4.42 g/L。根據實際情況，調整后的菌株產幾丁質酶最佳條件為:膠體幾丁質濃度12.0 g/L、酵母膏濃度4.5 g/L、發酵溫度20℃、初始p H7.0、轉速為220 r/min、裝液量75 mL/250 mL、接種量1%、發酵時間120 h。此最優發酵條件下，菌株產幾丁質酶活力達5.10 U/mL，較優化前酶活4.57 U/mL提高了11.50%。本研究為菌株LG－1發酵產酶提供了更好的條件，利于實驗中高產量、高活性幾丁質酶的獲取，為低溫幾丁質酶的降解機制研究和產業化應用提供了有力支撐。