硝酸鹽促進環磷酸腺苷發酵合成的生理機制研究

李志剛，顧 陽，陳寶峰，王寶石，張中華，常景玲，*

(1.現代生物育種河南省協同創新中心，河南新鄉453003;2.河南科技學院生命科技學院，河南新鄉453003)

環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是生物體內廣泛存在的一種生理活性物質，對細胞的各種代謝活動以及核酸和蛋白質等物質的合成具有重要的調節作用［1］。該物質在體內可以促進心肌細胞存活，增強心肌細胞抗損傷、抗缺血和抗缺氧能力，臨床上主要用于心功能不全、心絞痛和心肌梗死等疾病的治療，另外，其作為飼料添加劑廣泛應用于畜禽產品的生產中，具有十分重要的應用價值［2－3］。

微生物合成cAMP代謝過程涉及糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、嘌呤核苷酸合成途徑、腺苷酸合成途徑和三羧酸循環，代謝流分配情況是影響cAMP合成的重要因素［4］。Chen等［5］利用不同的抑制劑調節糖酵解途徑代謝強度，結果表明氟化鈉顯著提高了cAMP的產量和得率。Niu等［6］利用13C示蹤實驗對添加氟化鈉條件下的碳流分配情況進行研究，結果表明糖酵解途徑代謝強度明顯下降，同時磷酸戊糖途徑的代謝強度顯著上升。此外，Niu等［7］利用比較轉錄組和蛋白質組學分析方法對高溶氧條件下cAMP產量顯著提高的原因進行研究，發現糖酵解途徑中酶的轉錄水平明顯下降，而三羧酸循環和嘌呤核苷酸合成途徑中酶的轉錄水平和表達量明顯上升。因此，合理調節碳流在糖酵解和磷酸戊糖途徑間的分配，能夠有效促進cAMP的積累。

6－磷酸葡萄糖脫氫酶是改變碳流分配的關鍵酶，活性受NADPH的反饋抑制，消除過量的NADPH有利于碳流更多的分配到磷酸戊糖途徑［8］。硝酸鹽是一種氧化性強的氮源，在硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶順序催化作用下轉化為銨態氮，同時該還原反應需要NADPH作為輔酶才能進行［9－10］。微生物利用硝酸鹽的過程會消耗大量NADPH，還原性輔酶NADPH水平下降會提高6－磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，還會影響其他代謝途徑中酶的活性，進而改變代謝流分配情況［11－13］。

本文針對cAMP從頭合成途徑的代謝特點，通過適量添加硝酸鈉的方式促進產物合成，并從cAMP發酵動力學、還原性輔酶水平、關鍵酶活性、胞內氨基酸水平以及能量代謝水平等方面進行研究，闡明硝酸鹽促進cAMP發酵合成的生理機制，為硝酸鹽在核苷酸類產品發酵生產中應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

節桿菌(Arthrobacter sp.)A.sp01 本實驗室篩選并保藏于中國典型培養物保存中心(保藏號為CCTCC No.M2013431);cAMP、ATP、AMP、NADH、NAD+分析純，阿拉丁生化科技股份有限公司;苯酚、次氯酸鈉、水楊酸、對氨基苯磺酸、α－萘胺 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;6－磷酸葡萄糖脫氫酶試劑盒、NADPH與NADP+濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;AccQ－Tag氨基酸分析試劑包、氨基酸柱 沃特世科技(上海)有限公司(Waters);其他試劑 均為市售國產或進口分析級純。

LDZX－50KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;SW－CJ－2FD雙人垂直凈化工作臺 蘇凈集團安泰公司制造;ZWF－2112搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;UV－2800紫外分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;BIOTECH－7BG機械攪拌式發酵罐 上海保興生物設備有限公司;Aglient 1260 Infinity液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;VC150超聲波破碎儀 美國Sonics＆Materials公司;pH和DO電極 瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 斜面培養基、種子培養基和發酵培養基的組成及配制參見文獻［14］。

1.2.2 培養方法

1.2.2.1 發酵罐培養 7 L機械攪拌式發酵罐配備pH和DO電極各一支，裝載發酵培養基5 L(初始葡萄糖濃度為80 g/L)。121℃、高壓蒸汽滅菌20 min，接種量10%，發酵溫度30℃，初始pH調節至7.4待下降至6.8時保持不變，攪拌轉速初始400 r/min視溶氧變化情況逐漸增加至500 r/min，通風量從起始的0.1 vvm提升至0.6 vvm。

1.2.2.2 硝酸鹽添加方法 發酵罐發酵實驗:發酵過程進行至24 h一次性添加3 g/L－broth的硝酸鈉。搖瓶發酵實驗:設置1、2、3、4和5 g/L－broth等5個不同添加量和0、16、24和36 h等4個不同添加時間，共計20個不同組合，每個組合作3個平行試驗。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 菌體濃度(OD600)和菌體干重(DCW)測定 菌體濃度采用光密度法測定，發酵液稀釋適當倍數，在600 nm波長下測吸光度，所測數值乘以稀釋倍數即為OD600;菌體干重通過關系式DCW(g/L)=0.46×OD600計算得出［15］。

全省濕地總面積2606萬畝，有效維護生態平衡、保護生物多樣性。圖為“國際重要濕地”黃河三角洲國家級自然保護區。

1.2.3.2 葡萄糖濃度測定 采用DNS法進行測定［15］。

1.2.3.3 cAMP與次黃嘌呤測定 使用高效液相色譜進行測定［5］，取適量發酵液于離心管中，9000 r/min，離心10 min。上清液經過0.45μm孔徑的水相膜過濾后待測。色譜條件:色譜柱為Lichrospher C18柱(4.6 mm×300 mm，5μm)，進樣量5μL，有機相為甲醇，水相為磷酸三乙胺緩沖液(0.6%的磷酸溶液，用三乙胺調p H為6.6)，水相與有機相體積比為70∶30，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，波長254 nm。

1.2.3.4 pH和CO2含量測定 p H由發酵罐配備的電極在線測定，尾氣中CO2含量由尾氣分析儀在線測定。

表1 硝酸鈉不同添加時間和添加量對cAMP發酵產物濃度的影響(g/L)Table 1 The effects of sodium nitrate on cAMP fermentation production with different addition time and amounts(g/L)

1.2.3.6 細胞內ATP、AMP、NADH和NAD+濃度測定取5 mL發酵液，在4℃、9000 r/min條件下離心10 min。所得菌體于液氮中處理2 min，使細胞代謝瞬間停止。用PBS緩沖液洗滌細胞兩次，重新懸浮在5 mL的PBS緩沖液中，冰浴條件下超聲波破碎10 min，超聲3 s，停5 s。在4℃，12000 r/min條件下離心15 min，上清液用0.22μm孔徑的濾膜過濾后待測。ATP、AMP采用高效液相色譜法進行測定，具體方法參見文獻［15］;NADPH與NADP+濃度采用試劑盒進行測定，操作方法和步驟按照說明書進行。

1.2.3.7 關鍵酶活性測定 6－磷酸葡萄糖脫氫酶活性采用試劑盒進行測定，操作方法和步驟按照說明書進行;異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和琥珀腺苷酸合成酶活性測定方法參見文獻［18］，比酶活以U/mg蛋白表示。

1.2.3.8 蛋白濃度測定 采用考馬斯亮藍染色法測定［18］。

1.2.3.9 胞內氨基酸濃度測定 在不同發酵時期，分別取50 mL發酵液，12000×g離心10 min，使用超純水洗滌2次。細胞重懸于1 mL 10%(w/v)的三氯乙酸中，37℃放置10 min，煮沸15 min。12000×g離心10 min除去細胞碎片，上清經0.22μm濾膜過濾后［19－20］，采用Waters公司開發的AccQ－Tag法進行測定，操作方法和步驟按照說明書進行。

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 硝酸鈉最佳添加時間與添加量的確定

在250 mL錐形瓶中進行了添加硝酸鈉的cAMP發酵實驗，以產物濃度為指標確定最佳添加時間和添加量。如表1所示，硝酸鈉添加量和添加時間對cAMP產量均有較為明顯的影響，24 h添加3 g/Lbroth硝酸鈉時cAMP濃度達到最高的3.58 g/L，比對照提高了36.6%，與其他組合條件相比具有顯著差異。因此，將24 h添加3 g/L－broth硝酸鈉確定為最佳操作條件，在7 L發酵罐上進行發酵實驗。

2.2 硝酸鹽對7 L發酵罐中cAMP發酵性能的影響

在7 L機械攪拌式發酵罐上進行了添加硝酸鈉的發酵實驗，添加時間為24 h，添加量為3 g/Lbroth，其它操作條件與對照批次一致。如圖1所示，添加硝酸鈉發酵批次的cAMP終產量達到5.02 g/L，比對照批次提高了22.7%，而葡萄糖消耗量有一定幅度的下降，cAMP對葡萄糖的得率達到了0.097 g/g，比對照提高了29.8%。在發酵中后期(36～60 h)，對照批次的產物合成速率明顯變慢，產物增加量很少，而添加硝酸鹽批次的產物合成仍較為活躍，合成量比對照批次高出約1.0 g/L，有效促進了產物的合成與積累。這可能是由以下3個原因導致的:a.硝酸鈉作為一種氧化性氮源，利用過程消耗大量還原力(NADPH或NADH)，一定程度上影響了菌體的生長和葡萄糖的利用;b.還原力的消耗緩解了NADPH對6－磷酸葡萄糖脫氫酶的反饋抑制，使碳流更多的分配到產物合成途徑;c.還原力的消耗致使副產物(乙酸和乳酸)合成大幅下降，從而提高了產物的轉化率。由圖1C可知，兩批次中pH均呈現先降后升的趨勢，在36 h后添加硝酸鹽批次的pH回升速度明顯快于對照批次，有機酸合成量減少和堿性物質生成導致p H的迅速回升。添加硝酸鹽批次尾氣中CO2比例明顯高于對照批次(圖1D)，表明菌體的代謝活性得到增強。

另外，兩批次中次黃嘌呤濃度在40 h后均降到0.2 g/L以下，且基本沒有變化，cAMP是通過從頭合成途徑進行合成的。cAMP的從頭合成途徑涉及到糖酵解與磷酸戊糖途徑間的碳流分配、能量供應以及氨基酸供應等問題，因此，可以從硝酸鹽利用、代謝途徑關鍵酶活性水平、輔因子和ATP變化規律、氨基酸代謝等方面闡明硝酸鹽促進cAMP合成的生理機制。

2.3 硝酸鹽對氮代謝和細胞內還原性輔酶水平的影響

圖1 添加硝酸鈉對cAMP發酵性能的影響Fig.1 The effect of sodium nitrate on cAMP fermentation performance

硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶必須要有還原型輔酶(NADH或NADPH)提供還原力才能完成催化反應，因此，對反映細胞內氧化還原狀態的NADH/NAD+和NADPH/NADP+進行測定。如圖3所示，添加硝酸鹽批次細胞內NADH/NAD+明顯高于對照批次的，而NADPH/NADP+卻明顯低于對照批次的，表明上述兩種還原酶主要以NADPH作為輔酶來還提供原力，而NADH/NAD+的提高表明細胞能量代謝得到強化。這也解釋了添加硝酸鹽批次呼吸代謝旺盛而菌體濃度較低的現象，NADPH/NADP+的大幅降低，使細胞組分的合成受到影響，進而影響菌體生長。

2.4 硝酸鹽對cAMP合成途徑中關鍵酶活性的影響

微生物合成cAMP過程涉及到糖酵解、磷酸戊糖途徑、嘌呤核苷酸合成途徑以及三羧酸循環等。代謝流在不同途徑間的分配對產物合成具有顯著影響，而代謝網絡中關鍵節點處酶活性變化反映了代謝途徑的強弱和碳流分配情況。

圖2 添加硝酸鈉時cAMP發酵液中銨態氮和硝態氮的變化情況Fig.2 Time courses ofand concentrations in fermentation with sodium nitrate added

如圖4所示，添加硝酸鹽批次的丙酮酸脫氫酶活性比對照批次有一定程度下降，糖酵解途徑的代謝強度弱化;而異檸檬酸脫氫酶、6－磷酸葡萄糖脫氫酶和琥珀腺苷酸合成酶的活性均一定程度上高于對照批次，表明代謝流更多的分配到磷酸戊糖途徑為產物合成提供碳骨架，同時三羧酸循環的代謝強度也得到強化。同時細胞內高NADPH/NADP+水平會抑制6－磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，本文中硝酸鈉利用過程以NADPH為輔酶，使胞內NADPH/NADP+水平顯著下降，解除或緩解了對6－磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制作用，提高了該酶的活性，進而將更多的碳流分配到磷酸戊糖途徑為產物合成提供碳骨架，促進了產物的合成。

圖3 硝酸鈉對胞內氧化還原水平的影響Fig.3 The effects of sodium nitrate on NADPH/NADP+and NADH/NAD+

圖4 硝酸鹽對cAMP發酵代謝過程中關鍵酶活性的影響Fig.4 The effects of sodium nitrate on the activities of sAMPase，PGH，ICDH and G6PD

2.5 硝酸鹽對c AMP發酵過程中氨基酸合成的影響

對添加硝酸鈉發酵批次的細胞內氨基酸含量進行測定，結果表明，添加硝酸鹽批次中有12種氨基酸的含量高于對照批次，其中6種氨基酸含量得到明顯提高，分別是天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和異亮氨酸(圖5)。天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸是微生物通過從頭合成途徑進行cAMP合成的前體氨基酸，能夠部分或整體的整合到嘌呤環上，是產物合成的材料來源;同時天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和精氨酸均是以三羧酸循環的代謝物為碳骨架進行合成的。硝酸鹽的利用不僅為氨基酸合成提供了氮素，還通過強化三羧酸循環提供了碳骨架，促進了氨基酸代謝，進而促進產物合成。

圖5 硝酸鹽對細胞內氨基酸合成的影響Fig.5 The effects of sodium nitrate on the amounts of intracellular amino acids

2.6 硝酸鹽對cAMP合成過程中能量代謝的影響

cAMP是由ATP在腺苷酸環化酶的催化下合成的，高ATP水平有利于產物的合成;而ATP/AMP則一定程度上體現了細胞內磷酸化水平和ATP合成水平。如圖6所示，添加硝酸鹽發酵批次的細胞內ATP含量和ATP/AMP均明顯高于對照批次，結合NADH/NAD+的提高，表明硝酸鹽能夠強化能量代謝，有利于胞內ATP的合成。

圖6 硝酸鹽對胞內ATP含量和ATP/AMP比的影響Fig.6 The effects of sodium nitrate on intracellular ATP concentration and ATP/AMP

3 結論

發酵24 h添加3 g/L－broth硝酸鈉時，cAMP發酵性能得到明顯提升。硝酸鹽利用過程消耗了大量NADPH，緩解了對6－磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制作用，同時糖酵解途徑受到抑制而磷酸戊糖途徑和三羧酸循環中關鍵酶活性明顯提高，更多碳流分配到產物合成途徑。此外，胞內前體氨基酸水平、NADH/NAD+和ATP/AMP均得到明顯提高，為cAMP的發酵合成與積累提供了物質和能量基礎。硝酸鹽利用過程消耗了大量的還原力，改變了代謝流分配情況，提高了胞內氨基酸水平和ATP合成，為cAMP發酵合成提供了物質和能量基礎。硝酸鹽作用機制的闡明，為提高核苷酸類發酵產品的生產水平提供了參考。