冠突散囊菌發酵對葛根的活性物質和抗氧化活性的影響

杜 靜，王琪琪，王云勝，張傳博

(貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽550001)

葛根具有極高藥用價值的同時還具有營養保健功效，是一種“藥食同源”的植物［1－2］。它含有豐富的活性成分，尤其是研究最為廣泛的異黃酮類物質，包括葛根素、芒柄花素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素等，具有廣泛的抗氧化活性，在治療心腦血管疾病及改善血脂等方面有著巨大潛力［3－5］。葛根異黃酮的存在形式一般有兩種，游離型苷元和結合型糖苷，前者包括大豆苷元等，后者包括葛根素和大豆苷等［6－8］，此外有研究表明，苷元型異黃酮生物活性更強，且異黃酮多以苷元型在體內發揮作用［9－11］。

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)作為茯磚茶“發花”工藝中的優勢菌，是一種重要的藥用真菌，它能分泌多種酶，包括多酚氧化酶、單寧酶、纖維素酶、蛋白酶等，具有降脂、抗氧化等多種醫療保健功能，且對營養環境沒有特殊要求，易于生長［12－13］。同時有文獻以發酵培養的方式對該菌的次級代謝產物及其生物活性進行研究，表明其代謝產物具有很強的抗氧化作用［14］。

目前已有研究證實可用微生物轉化葛根，諸如利用黑曲霉、香菇、紅曲霉等轉化葛根以生產黃酮等，或研制靈芝發酵顆粒沖劑等，且有研究表明經發酵葛根的抗氧化能力也會得到提高［15－19］。但大部分研究都基于葛根渣或者使用一些常見菌種進行發酵。在前人的研究基礎之下，本研究選用茯磚茶中的優勢菌冠突散囊菌發酵葛根，探究冠突散囊菌發酵對葛根的影響，對比發酵前后葛根部分活性成分以及抗氧化活性的變化，以期為葛根資源的進一步開發及中藥現代化提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冠突散囊菌(Eurotium cristatum) 分離自陜西茯磚茶，為貴州師范大學微生物重點實驗室分離保存菌種;鮮葛根 由貴州省隆熙源生態農業有限公司提供，經實驗室切片、35℃烘干處理備用;蘆丁標準品、葛根素標準品、大豆苷標準品、大豆苷元標準品 HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司;1，1－二苯基－2－苦基肼(DPPH)、抗壞血酸、色譜級甲醇 天津市恒興化學試劑制造有限公司;娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司;其他試劑 均為分析純。

RE－2000旋轉蒸發器 上海洪旋實驗儀器有限公司;FS－600N超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司;DH6000II電熱恒溫培養 天津市泰斯特儀器有限公司;UV759CRT紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冠突散囊菌孢子懸浮液制備 參照胡謝馨等［20］的方法，略有改動。將冠突散囊菌接種于PDA培養基，28℃恒溫培養5 d后刮取冠突散囊菌孢子放入盛有100 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，120 r/min搖床振蕩30 min，最終稀釋成濃度4×106個/mL孢子懸浮液待用。

1.2.2 固體發酵 采用胡謝馨等［20］的方法，略有改動。取冠突散囊菌孢子懸浮液，分別接種到葛根固體發酵基質(干葛根片40 g，水40 mL)和大米固體發酵基質(大米40 g，水50 mL)上，接種量為培養基的重量的5%，28℃恒溫培養。接種10 d左右，基質已布滿冠突散囊菌菌絲，生長達到旺盛，發酵結束。

1.2.3 葛根發酵物的提取制備 參照肖楠等［21］的方法，略有改變，提取制備發酵產物。將發酵產物，即發酵后得到的復合物，于30℃烘干、粉碎，稱取10 g粉碎后的產物，采用醇提法進行提取(95%乙醇，料液比1∶10，浸泡過夜后超聲提取三次)，抽濾去其殘渣，將提取液于40℃旋轉蒸發除去乙醇得浸膏，記做FG。以大米培養基發酵的冠突散囊菌和未發酵的葛根作對照，按照同樣的方法提取，分別記做DM和WG。

1.2.4 總黃酮含量測定 采用紫外分光光度法測量葛根發酵前后提取物的總黃酮含量［22－23］。以蘆丁為標準品(0.2 mg/mL)，并配制成系列濃度，于510 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。取待測樣品于相同條件下測其吸光度，根據標準曲線計算其總黃酮含量。

1.2.5 葛根發酵前后異黃酮含量的HPLC分析

1.2.5.1 色譜條件 參照楚紀明等［24］的方法和藥典［25］并進行改變，色譜條件如下:Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相水(A)－甲醇(B)，梯度洗脫(0～20 min，25%B;20～50 min，25%～55%B;50～80 min，55%～25%B);檢測波長250 nm;柱溫30℃;流速0.7 mL/min;進樣量10μL。

1.2.5.2 溶液制備 各提取物用50%甲醇溶解稀釋成所需質量濃度，即為供試樣品溶液;精密稱取葛根素、大豆苷、大豆苷元標準品各5 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，即為混合對照品溶液。

1.2.5.3 方法專屬性考察 分別取“1.2.5.2”項下的供試樣品溶液和混合標準品溶液，按“1.2.5.1”項下色譜條件進樣。

1.2.5.4 線性關系考察 分別取“1.2.5.2”項下的混合對照品溶液1、2、3、4、5 mL，用50%甲醇定容至10 mL，按“1.2.5.1”項下色譜條件進樣。

1.2.5.5 方法學考察 參考邵建兵［26］、高晗［27］、姚少姿［28］等的方法，進行方法學考察。精密度試驗:取“1.2.5.2”項下的混合對照品溶液，連續進樣6次，測定峰面積，計算各標準品峰面積的RSD;重復性試驗:按“1.2.5.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.5.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算RSD;穩定性試驗:取供試樣品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，記錄峰面積，計算各標準品的含量與RSD;加樣回收率試驗:取已知含量的樣品，加入一定量各標準品，照“1.2.3”項條件重新提取，并制備供試樣品溶液，按“1.2.5.1”項色譜條件進樣，計算加樣回收率及RSD。

1.2.6 體外抗氧化能力測定 采用DPPH法［29－32］測定發酵前后葛根的體外抗氧化活性。取2 mL各濃度樣品，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，振蕩搖勻，室溫下避光反應30 min，于517 nm處測其吸光值，記做Ai;以等量的甲醇代替DPPH溶液，相同條件下測得吸光值，記做Aj;以等量的50%甲醇代替樣品溶液，相同條件下測得吸光值，記做Ac。每個組實驗做3個平行，以相同濃度的抗壞血酸溶液做參照，用甲醇溶液調零。DPPH自由基清除率的計算公式如下:

1.3 數據處理

用Excel 2010進行數據統計，GraphPad Prism7.0作圖并計算IC50值。

2 結果與分析

2.1 總黃酮含量測定

在葛根基質上冠突散囊菌長勢良好，在接種的第2 d就有明顯的白色菌絲產生，且較PDA培養基和大米培養基長勢更快，說明葛根能為冠突散囊菌提供其所需的各種營養成分。對葛根發酵前后的總黃酮含量測定結果如下:以量取的蘆丁標準溶液的體積為橫坐標(X)，吸光值為縱坐標(Y)進行回歸，得到線性回歸方程:Y=0.2856X+0.1533，R2=0.9991，在1.25～10 mL范圍內線性關系良好。

發酵前后的樣品總黃酮平均含量分別為5.08和5.29 mg/g(n=3)，可知發酵后的總黃酮含量比發酵前有所提高，這一現象說明，冠突散囊菌發酵葛根可以提高其總黃酮的含量。

2.2 葛根發酵前后提取物的HPLC分析

2.2.1 方法專屬性考察 供試樣品溶液和混合標準品溶液進樣測定，得到色譜圖如圖1所示。由圖1可知，特征峰明顯，與雜質分離良好，無干擾。且經和對照品比對，確定1、2、3號峰分別為葛根素、大豆苷、大豆苷元。

2.2.2 線性關系考察 以進樣濃度(X，mg/mL)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，得到葛根素、大豆苷、大豆苷元的回歸方程分別是Y=61809.1792X－1.0365(R2=0.99996)，Y=20385.4471X+46.4521(R2=0.99904)，Y=20683.0913X+28.7612(R2=0.99940)。結果表明，三者在0.02～0.1 mg/mL范圍內均具有良好的線性關系。

2.2.3 方法學考察 精密度試驗:連續進樣6次，葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面積的RSD值分別為0.19%、1.89%、1.86%(n=6)，表明儀器精密度基本良好。

重復性試驗:測得樣品中葛根素、大豆苷、大豆苷元含量的RSD值分別為1.80%、1.75%、1.58%(n=6)，表明該方法的重現性良好。

穩定性試驗:測定10 h內樣品中葛根素、大豆苷、大豆苷元含量的RSD值分別為0.58%、1.95%、1.16%(n=6)，表明在10 h內，樣品基本穩定。

加樣回收率試驗:測得結果見表1，由表1可知葛根素、大豆苷、大豆苷元的平均回收率分別為100.81%、99.40%、95.56%，RSD值 分 別 為0.58%、0.61%、0.52%(n=6)。

圖1 供試品(A)和對照品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of substances(B)and sample(A)of Pueraria lobata

2.2.4 樣品含量測定 樣品中葛根素、大豆苷、大豆苷元含量測定結果見表2。結果表明，陰性對照組DM，即用大米培養基培養的冠突散囊菌樣品，未檢測到三者相應的吸收峰;而發酵前后三者含量變化顯著，發酵產物中葛根素和大豆苷元的含量分別是未發酵葛根的1.6倍和4.9倍，而大豆苷的含量則降低了，相比未發酵葛根其含量少了近1/2。

2.2.5 色譜比對分析 在1.2.5.1色譜條件下，對發酵前后以及陰性對照組DM的圖譜進行疊加比對分析，圖譜見圖2。由圖2可知，陰性對照組DM的圖譜中基本沒有檢測到相應的峰;而發酵組FG與未發酵組WG則檢測出較多的峰。根據圖譜差異性分析可知，在相同的進樣濃度下，經冠突散囊菌發酵，葛根中的化學成分發生顯著變化，其中1～5號以及8號吸收峰經過發酵以后強度變弱，而9號、10號和11號吸收峰經發酵則得到更強的吸收峰，其中10號吸收峰為WG組所沒有的。可以推測，葛根經過冠突散囊菌的發酵后，通過兩者相互之間的轉化作用使得葛根或者真菌本身的代謝產物發生了改變，從而導致了物質成分的變化。

2.3 體外抗氧化能力測定

由圖3可知DPPH自由基的清除率隨各樣品濃度的增加而增加，尤以陽性對照組VC的清除能力最強，但當樣品濃度達到4 mg/mL時，四者對DPPH自由基的清除率能力基本持平。而當樣品濃度小于0.5 mg/mL時，發酵后的葛根FG對DPPH自由基的清除率明顯高于陰性對照組DM和未發酵葛根WG，當樣品濃度大于0.5 mg/mL時，則DM的抗氧化性略高于發酵后的葛根FG。但無論是發酵后的葛根(FG)還是陰性對照組(DM)在各個濃度下對DPPH自由基的清除率都比未發酵葛根(WG)高。四者的IC50(mg/mL)值見表3，由表3可知，四者的抗氧化活性由強到弱依次為:VC＞FG＞DM＞WG。

表1 加樣回收試驗結果(n=6)Table 1 Results of sample recovery test(n=6)

表2 葛根樣品中各物質含量測定結果(x±s，n=3)Table 2 Results of various substancesin P.lobata samples(x±s，n=3)

圖2 發酵組FG、未發酵組WG和陰性對照組DM的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of fermentation group FG and unfermented group WG and negative controlled substance DM

3 討論與結論

本研究基于冠突散囊菌與葛根的雙向固態發酵體系，經HPLC指紋圖譜比對分析，發現發酵前后葛根成分變化顯著，對其中三種異黃酮成分的含量進行測定，結果葛根素和大豆苷元含量顯著增加，而大豆苷的含量減少。此結果與施英英［33］研究結果不同，其研究結果為大豆苷元減少，而葛根素和大豆苷均增加，推測造成該現象的原因如下，首先使用的菌種不同，其所具有的酶系和代謝產物有很大差別;其次，其固態發酵培養基中除了葛根渣外還含有30%的麩皮，而麩皮中也含有一些類黃酮物質。

圖3 各樣品濃度與DPPH自由基清除率的關系Fig.3 The relationship between the concentration of each sample and the scavenging rate of DPPH radical

表3 葛根發酵前后抗氧化IC50值(n=3)Table 3 IC50 value before and after P.lobata fermentation(n=3)

通過測定發酵前后總黃酮的含量，結果顯示發酵后總黃酮含量僅略微提高;同時HPLC色譜比對發現DM組的發酵產物中不含此3種異黃酮;此外，資料表明葛根中的異黃酮類物質結構相似，只在取代基或酚羥基位置有所差別［34］;由此推測導致異黃酮含量發生變化的原因很可能是葛根中異黃酮結構類似物之間利用冠突散囊菌在代謝過程中產生的一系列酶發生相互轉化［35－36］，而其具體的轉化途徑還需要進一步研究。

對發酵前后葛根的抗氧化活性進行DPPH法評價分析，結果表明發酵后產物對DPPH自由基有一定的清除作用，具有一定的抗氧化活性，且其抗氧化活性遠遠大于未經處理的葛根，也比單純的菌種的抗氧化活性強。但是，由于在DM的色譜圖中并未檢測到葛根主要異黃酮成分相應的吸收峰，而其抗氧化活性卻遠高于未發酵的葛根，甚至接近于發酵葛根，故推測冠突散囊菌本身的代謝產物對抗氧化活性的改變發揮著重要作用，其作用甚至遠大于葛根異黃酮含量的提高。李瑩［37］從冠突散囊菌的大米發酵產物中分離鑒定了11個化合物，其中化合物6(Variecolorin O)和化合物7(Neoechinulin A)表現出較強的抗氧化活性;李玉婷等［38］研究表明冠突散囊菌中的黃色素具有優于VE的抗氧化活性;彭曉赟等［14］從冠突散囊菌的發酵產物中分離鑒定了9個化合物，其中4種苯甲醛類化合物具有很好的抗氧化作用等，這些研究結果均進一步印證了上述推測。同時，由于只采用了一種體外抗氧化活性評價方法，故不能對葛根發酵前后的抗氧化活性進行總體評價，因此論據略有不足，還需要多采用幾種評價方法，進一步驗證其體外抗氧化活性。

綜上所述，利用冠突散囊菌發酵葛根，可以提高葛根中的部分活性成分的含量，且發酵后產物具有一定的抗氧化活性。而目前對于冠突散囊菌的研究多集中在分離鑒定、命名及其化學成分的研究上，亦或是探究其對茯磚茶口感品質的作用，而很少研究冠突散囊菌在其他方面的應用。本研究利用冠突散囊菌對中藥材葛根進行固體發酵，大大提高該菌研究潛力和價值的同時，也為葛根資源的進一步開發，甚至是中藥炮制提供一個研究思路和方向，推動中藥的現代化進程。