響應面法優化黃精 大棗果酒發酵工藝及其抗氧化活性

宋藝君，郭 濤，劉世軍，呂慧鋒，徐娜娜，葉 建，焦 慧，賀如夢

(1.陜西中醫藥大學藥學院，陜西咸陽712046;2.空軍第九八六醫院藥劑科，陜西西安710054;3.西安千禾藥業股份有限公司 質量部，陜西西安710075)

黃精為百合科植物黃精Polygonatum sibiricum Red.、多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua或滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.的干燥根莖，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎的功效，用于脾胃氣虛，體倦乏力，胃陰不足，口干食少，肺虛燥咳等［1］。黃精主要含有多糖、皂苷、多酚、黃酮等成分，另外還含有多種氨基酸和微量元素［2］，具有抗衰老、提高免疫力、降血糖、抗病原微生物等作用［3－4］。大棗來源于鼠李科植物棗(Ziziphus jujuba Mill.)的干燥成熟果實［1］，具有補中益氣，養血安神的作用，用于脾虛食少，乏力便溏，婦人臟躁等［1］。大棗富含糖類、粗纖維、維生素、氨基酸、礦物質等多種營養成分［5－7］，其中，多糖是大棗中具有重要生物功能的成分，營養保健價值很高［8－10］?，F代藥理研究發現黃精、大棗均有抗氧化活性，且配伍后抗氧化作用增強，同時黃精、大棗均為藥食兩用中藥，近年來，隨著保健、營養食品的發展，黃精、大棗開始逐漸用于食品制造［11－14］，如飲料、果丹皮等。

以果汁或新鮮水果為原料，經過破碎、榨汁，經部分或全部發酵釀制而成的酒，稱為果酒。采用干果加水發酵保健果酒，發酵時間比較靈活，解決了原料的季節性問題，干果發酵避免了打漿的過程，對干果溫浸后發酵即可，且干果不容易霉變，使原料的貯存更容易。果酒品質受到發酵工藝、物料質量及酵母用量等因素影響［15－18］，所以確定最優發酵工藝條件對釀造的果酒的質量至關重要。

本試驗采用響應面試驗設計，以酒精度和感官評分的總評歸一值為評價指標，優化黃精－大棗果酒主發酵工藝，同時還采用1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)法，2，2－聯氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二銨鹽(ABTS)法測定不同發酵時間黃精－大棗果酒的抗氧化活性。通過對黃精－大棗果酒發酵工藝和抗氧化活性的研究，可為黃精－大棗果酒的發酵提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精 購自陜南;大棗 購自渭南市合陽縣，由陜西中醫藥大學藥學院王繼濤教授分別鑒定為百合科植物黃精(Polygonatum sibiricum Red.)的干燥根莖，鼠李科植物棗(Zizyphus jujuba Mill.)的干燥成熟果實;XR干酵母 法國諾盟集團;果膠酶 法國LAFFORT公司;偏重亞硫酸鉀 天津市科密歐化學試劑有限公司;ABTS、DPPH對照品 上海生物科技有限公司;白砂糖(食品級)人人樂超市;純凈水 咸陽漣漪有限公司;其余試劑 均為分析純。

SPX－Ⅱ型生化培養箱 上海新苗醫療器械公司;APLI型手持折光儀 衡州艾普計量儀器公司;BT－25S型電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司;UV2550型紫外可見分光光度計 島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精大棗果酒發酵工藝流程 大棗+黃精→加水浸泡、煎煮→過濾→藥液→酵母活化→成分調整→接種發酵→倒瓶→后發酵→澄清→灌裝→殺菌→陳釀→成品

1.2.1.1 黃精的加工炮制 取黃精藥材，按照2015版《中國藥典》黃精飲片方法炮制［1］。

1.2.1.2 酵母活化 于XR干酵母中加入大約10倍量38～42℃水，在40℃恒溫水浴鍋活化0.5 h，每隔10 min攪拌一次［19－20］。

1.2.1.3 操作要點 大棗剔除棗核、切小塊，黃精切片，將兩種物料按不同配比組合，放入燒杯，并加入適量水浸泡30 min，煎煮(沸騰后文火30 min)，煎煮液用紗布過濾，濾液加入一定量酵母后在25℃靜置發酵，發酵前3 d每天保持攪拌1次，發酵液無氣泡后發酵基本完成。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 (黃精∶大棗)物料組分比對果酒發酵效果的影響 選取1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1(g/g)物料組分比，控制酵母用量0.5 g/L，液料比20∶1(mL/g)，以酒精度和感官評分為評價指標確定物料組分比。

1.2.2.2 液料比對果酒發酵效果的影響 選取15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1(mL/g)液料比，控制(黃精∶大棗)物料組分比1∶1(g/g)，酵母用量0.5 g/L，以酒精度和感官評分為評價指標確定液料比。

1.2.2.3 酵母用量對果酒發酵效果的影響 選取0.1、0.3、0.5、0.7 g/L酵母用量，控制物料組分比(黃精∶大棗)1∶1(g/g)，液料比20∶1(mL/g)，以酒精度和感官評分為評價指標確定干酵母用量。

1.2.3 響應面優化試驗 以單因素實驗結果為基礎，進行三因素三水平的響應面試驗，確定黃精－大棗果酒最優的主發酵條件，試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.4 發酵指標的測定

1.2.4.1 感官評價 黃精－大棗果酒酒體淡黃色，醇香可口，具有黃精和大棗特有的香味，無異味，澄清。由10名專業人員組成的感官評定小組參照GB/T 15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對黃精－大棗果酒從澄明度(25分)、色澤(25分)、滋味(25分)和香氣(25分)4個方面進行感官評定，酒樣總分為4項得分之和，滿分為100分。感官評分標準見表2。

1.2.4.2 酒精度測定 按GB/T 15038－2006相關規定執行。

1.2.4.3 理化指標和微生物指標的測定 按GB/T 15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中規定的方法測定果酒中的總糖、總酸、干浸出物指標。按GB/T 4789.2、GB/T 4789.3、GB/T 4789.4、GB/T 4789.5、GB/T 4789.10規定的方法測定微生物指標。

表2 果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fruit wine

1.2.5 抗氧化活性試驗 黃精－大棗果酒的抗氧化活性試驗分為對DPPH﹑ABTS自由基的清除能力的測定，參考文獻方法測定。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定 參考文獻方法［21］。稱取9.85 mg DPPH以無水乙醇定容至250 mL作為DPPH工作液，在反應體系中，于10 mL試管中加入200μL不同濃度的樣品溶液，再加入2 mL DPPH工作液，振蕩搖勻，于室溫下避光靜置30 min，測定517 nm處的吸光值，以加入等量的超純水作為空白對照。以樣品濃度為自變量，自由基清除率為因變量作圖并進行線性擬合，計算IC50值，其中IC50值定義為清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度，所需濃度越低，表明該物質抗氧化性越強。

DPPH自由基清除率(%)=(1－As/A0)×100

其中:As為樣品管的吸光值，A0為對照管的吸光值。

1.2.5.2 ABTS自由基清除能力的測定 參考文獻方法［21］。稱取0.1920 g ABTS，0.0331 g K2S2O8于燒杯中，并用去離子水定容至50 mL，使ABTS濃度為7 mmol/L，過硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L，將該溶液于室溫下暗處靜置12～16 h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)稀釋至734 nm處吸光值為0.70［22］。反應體系中，于10 mL試管中加入20μL不同濃度的樣品，再加入2 mL ABTS反應液，振蕩搖勻，室溫下靜置10 min，測定反應液在734 nm處的吸光值，以不加入樣品的ABTS自由基溶液為空白對照，并計算IC50值。

ABTS自由基清除率(%)=(1－As/A0)×100

其中，As為樣品管的吸光值，A0為對照管的吸光值。

1.3 數據處理

采用Excel軟件進行數據分析和作圖，采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計和結果分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 物料組分比對主發酵效果的影響 由圖1可知，當黃精所占比例相對較小時，隨著其比例的逐步增加，果酒的感官評分也隨之增高，但酒精度指標變化不明顯;當黃精和大棗的比例達到3∶2(g/g)時，果酒的感官評分達峰值(93分);但當黃精比例繼續增加時，酒精度和感官評分均出現下降的趨勢。盡管黃精經發酵后產生的獨特風味可克服原料少釀酒香氣單一的缺點，但其所占比例增大后易使酒體出現較強的甜味。故當大棗、黃精兩者比例適當時，可賦予果酒特殊的風味，因此選擇物料組分比(黃精∶大棗)2∶3、1∶1和3∶2(g/g)用于后續響應面優化試驗設計。

圖1 物料組分比對主發酵的影響Fig.1 Effects of material composition ratio on main fermentation

2.1.2 液料比對主發酵效果的影響 由圖2可知，液料比在15∶1～25∶1(mL/g)范圍內變化時，果酒的評價指標(酒精度和感官評分)隨著溶劑比例的增大而增高，感官評分最高為91分，對應的酒精度也達到最大，為8.02%vol;當液料比進一步增大，易出現酒精度偏低、風味不佳的現象。因此選擇液料比20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)用于后續響應面優化試驗設計。

圖2 液料比對主發酵的影響Fig.2 Effects of water/material ratio on main fermentation

2.1.3 酵母用量對主發酵效果的影響 由圖3可知，當酵母用量處于0.1～0.5 g/L時，隨著其用量的逐步增加，果酒的評價指標(酒精度和感官評分)也隨之增加。一般酵母用量過低時，物料發酵不完全，造成發酵液酒精度偏低及酒香不明顯等現象。當酵母用量增加到0.5 g/L時，果酒的感官評分為90分;當酵母用量進一步增加時，酒精體積分數雖有增大，但易造成酒醅發酵過于快速、整個果酒酒體出現苦味的現象。故選擇酵母用量為0.3、0.5、0.7 g/L用于后續響應面優化試驗設計。

圖3 干酵母用量對主發酵的影響Fig.3 Effects of dry yeast dosage on main fermentation

2.2 響應面優化發酵工藝

2.2.1 試驗設計和結果 在單因素實驗的基礎上，選取物料組分比(X1)、液料比(X2)、酵母用量(X3)為考察因素，以酒精度和感官評分的OD值(Y)為評價指標進行響應面試驗設計。OD值計算步驟［23］:采用Hassan法對酒精度(d1)和感官評分(d2)指標進行歸一化處理，di=(Mi－Mmin)/(Mmax－Mmin)。式中di為每一指標的OD值，Mi為指標測量值，Mmax和Mmin指每一指標在所有實驗中的最大值和最小值?？傇u歸一值(OD)=(d1+d2+d3+…dk)/k(k為指標數)。響應面試驗設計方案和結果如表3所示。

2.2.2 模型擬合和顯著性分析 采用Design－Expert 8.0.6軟件，將表3中的指標成分(酒精度和感官評分)的OD值進行多元回歸擬合和二項式分析，建立黃精－大棗果酒發酵工藝OD值(Y)對物料組分比(X1)、液料比(X2)、酵母用量(X3)的二次回歸模擬方 程Y=－5.02424+1.21322X1+0.36842X2+1.43136X3－0.084928X1X2+1.41747X1X3－0.15363X2X3

回歸模型的方差分析結果見表4。由表4可知，在1次項中，X1為顯著項(P＜0.05)，X2、X3為極顯著項(P＜0.01)，P值分別為0.0151、0.0022、0.0002，顯著程度X3﹥X2﹥X1，說明酵母用量對響應值的影響最大，液料比次之，物料組分比最小;2次項中，為顯著項(P＜0.05)，說明液料比對響應值的影響是非線性的;交互項中，X1X2、X2X3為極顯著項(P＜0.01)，X1X3為顯著項(P＜0.05)，表明X1和X2、X2和X3之間交互作用極顯著，X1和X3之間交互作用顯著。

擬合模型的P值小于0.01，本模型極顯著，失擬項的P值大于0.05，不顯著;該回歸模型的總決定系數R2=0.9294，調整決定系數，變異系數CV=5.08，以上參數均說明該模型擬合程度好，實驗誤差小，且模型的殘差可能是由隨機誤差所產生。模型能夠較好地反映物料組分比(X1)、液料比(X2)、酵母用量(X3)與酒精度和感官評分的OD值(Y)之間的變化關系，能夠用來對黃精－大棗果酒發酵工藝進行分析和預測。

按所得模型繪制物料組分比、液料比和酵母用量的交互作用對黃精－大棗果酒主發酵工藝影響的3D響應面圖如圖4所示。響應面圖是響應值對各影響因素所形成的三維空間曲面圖，通過響應面圖可形象看出最優取值點及各參數之間的相互作用［24］。由圖4可直觀看出各因素交互作用對果酒酒精度和感官評分的OD值的影響，如果曲線越陡，則表明該因素對果酒OD值的影響越大［25］。從圖4可看出X3(酵母用量)對果酒OD值的影響最大，X2(液料比)次之，X1(物料組分比)最后，與表4方差分析的結果一致。根據試驗分析結果，計算并預測二次回歸方程，結果黃精－大棗果酒最優主發酵工藝為物料組分比(黃精∶大棗)2∶3(g∶g)，液料比29.71(mL∶g)，酵母用量0.35 g/L，OD值為0.9852。

表3 響應面試驗設計和試驗結果Table 3 Design and results of response surface

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

圖4 X1、X2、X3交互作用的三維響應面圖Fig.4 3D response surface of X1，X2，X3 for their mutual interaction

2.3 驗證實驗

根據最優工藝篩選結果，結合實際情況，將黃精－大棗果酒最優主發酵工藝調整為物料組分比2∶3(g/g)、液料比30∶1(mL/g)，酵母用量0.35 g/L。根據各因素優選的結果進行3組平行驗證試驗，得到的黃精－大棗果酒的感官評分為(90.67±1.53)分，酒精度為9.23%±0.30%vol，測定結果穩定，偏差不大，說明該試驗結果合理可靠。

2.4 理化指標

經測得黃精－大棗果酒在最優發酵工藝條件下的酒精度為9.2%vol，干浸出物32.8 g/L，總酸7.2 g/L(以酒石酸計)，總糖37.4 g/L(以葡萄糖計)，半甜型。均符合國家標準的要求。

2.5 微生物指標

大腸菌群≤3 MPN/100 mL，菌落總數≤50 CFU/mL，致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌):不得檢出。均符合國家標準的要求。

2.6 黃精－大棗果酒發酵過程抗氧化活性的變化

2.6.1 黃精－大棗果酒發酵過程DPPH自由基清除率的變化 由圖5可知，黃精－大棗果酒發酵過程對DPPH自由基的清除率基本處于高水平，最高值99.5%，說明黃精－大棗提取液和發酵液均具有較強的清除DPPH自由基能力。圖5中DPPH自由基清除率先緩慢上升后緩慢下降，可能與發酵液中所含抗氧化成分多糖、多酚和黃酮的含量變化有關。0～72 h，DPPH自由基清除率升高，此階段果酒發酵速度較快，由于黃精、大棗前處理時的浸泡、煎煮使所含多糖、黃酮和多酚等成分溶出從而使其含量升高，抗氧化活性提升。72 h后是發酵后期，DPPH自由基清除率慢慢下降，可能是由于發酵過程中多糖的轉化，黃酮的不穩定性及多酚被分解，導致抗氧化活性降低［26－27］。

圖5 發酵過程DPPH自由基清除率的變化Fig.5 Changes of DPPH radical scavenging rate during fermentation process

2.6.2 黃精－大棗果酒發酵過程ABTS自由基清除率的變化 由圖6發現，ABTS與DPPH自由基清除率有相似的變化趨勢，總體呈現先升高后降低趨勢，72 h時最高值為92.0%。0～72 h，果酒發酵速度快，同樣由于黃精、大棗的浸泡、煎煮使所含多糖、黃酮和多酚等成分溶出從而使其含量升高，ABTS自由基清除率升高。72 h后，發酵速率降低，酒精含量最高，多糖、黃酮和多酚等抗氧化成分含量降低，ABTS自由基清除率降低。發酵結束后黃精－大棗果酒的ABTS自由基清除率略高于黃精－大棗提取液。

圖6 發酵過程ABTS自由基清除率的變化Fig.6 Changes of ABTSradical scavenging rate during fermentation process

3 結論

在單因素實驗結果的基礎上，對黃精－大棗果酒的主發酵工藝條件采用響應面法進行了優化，根據試驗結果，影響果酒評價指標的因素按主次順序依次為干酵母用量、液料比和物料組分比，最終確定黃精－大棗果酒最優主發酵工藝條件為:物料組分比2∶3(g/g)，液料比30∶1(mL/g)，酵母用量0.35 g/L;在此條件下得到的黃精－大棗果酒表現出均勻的淡黃色，酒香優雅，酒體協調，清澈透明，具有黃精和大棗典型風味;黃精－大棗果酒發酵過程中的DPPH清除率、ABTS清除率均呈現前期快速增長，后期逐漸下降的變化趨勢，其最大值分別達到了99.5%、92.0 %。