分散固相萃取-GC-MS法測定海產品中9種有機錫化合物

王 姮，胡紅美，郭遠明，金衍健，楊承虎

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山316022;2.浙江省海洋水產研究所，浙江舟山316021)

有機錫化合物(organotin compounds，OTs)是一類錫與碳元素結合的金屬有機化合物，常在工業、農業等領域被用作殺蟲劑、除草劑和船舶的防污涂料。它們具有高毒性，其中三丁基錫(tributyhin，TBT)和三苯基錫(triphyltin，TPhT)在水中達到ng/L水平就能引發海產腹足類生物的雌性不育甚至種群滅絕［1］。同時，OTs易富集于海洋生物的內臟、性腺和鰓中，具有一定的生物富集性［2］，研究表明，有機錫在魚類、貝類等生物體內生物濃縮系數(BCF)最高達8700000，并具有生物放大作用，一旦被人類食用，最終將威脅人類健康和生命。最近Chen等［3］研究中發現南方沿海地帶海產品中TPhT含量在246～1484 ng/g之間，說明我國南方沿海地區的海產品仍然存在嚴重的有機錫污染。在全國范圍內，中國每年生產約200 t TPhT［4］。因此加強針對有機錫化合物的探究對保護環境和保障食品安全都很重要。

通常采用氣相色譜－質譜法(GC－MS)［5－9］、氣相色譜－電感耦合等離子質譜法［10－11］和氣相色譜－脈沖火焰光度法［12－15］等測定海產品中的有機錫化合物。此外還有高效液相色譜法與電感耦合等離子質譜法聯用［16－17］、高效液相色譜－原子熒光光譜聯用法［18］、高效液相色譜－串聯質譜法［19－20］、石墨爐原子吸收光譜法［21］等檢測方法。且采用氣相色譜法時還必須結合衍生技術，將有機錫化合物轉化為易揮發的物質使其在分析過程中氣化但不分解。而相比氣相色譜法，液相法雖然無需衍生，但與其聯用的高靈敏檢測器較少［22］。由于GC－MS既有氣相色譜高效、快速的分離性能，又有質譜準確定性的優勢，目前在海產品中有機錫化合物檢測中將具有更廣泛的應用前景。

同時，不管選擇何種檢測方法，還需結合超聲波萃取、頂空單滴液相微萃取、固相微萃取、微波輔助提取、索氏提取等萃取技術和凝膠滲透色譜、固相萃取、層析柱凈化等凈化技術進行樣品前處理。但采用凝膠滲透色譜凈化時洗脫溶劑用量較大，設備運行成本高［23］;雖然層析柱的使用投入不大，但必須手動裝填，要用到大量的吸附劑而且重現性也很不理想;目前商品化的固相萃取小柱廣泛應用于不同樣品的凈化過程，但還要進行萃取柱活化、上樣、淋洗、洗脫等過程，較為費時間和人力，不太適用于處理大量的樣品。Anastassiades等［24］在2003年提出了分散固相萃取技術，這是一種快速、高效的凈化技術，為實現水產品有機錫快速前處理提供了新思路。該凈化技術只需要通過振蕩和過膜等方式，直接將吸附劑添加至提取液中進行凈化，還可以有效地除去水產品基質中的干擾物，實現了樣品快速、簡便的凈化處理［25］，但目前該法在水產品中OTs前處理方面鮮有報道。因此，針對有機錫檢測存在前處理過程復雜等問題，本文開發了超聲波萃取、分散固相萃取凈化，GC－MS法同時檢測海產品中9種有機錫化合物的新方法，并對前處理過程進行了優化，以滿足市場對靈敏度、精密度和準確度的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N－丙基乙二胺(Primary secondary amine，PSA，粒徑40～63μm)，C18(粒徑40～63μm)、硅膠吸附劑(Si，粒徑40～46μm)、弗羅里硅土(Florisil，粒徑60～100目)、中性氧化鋁(Alumina－N，粒徑100～300目)、石墨化炭黑(Graphitized carbon black，GCB，粒徑120～400目)、四乙基硼化鈉(NaBEt4)上海安譜科學儀器有限公司;9種OTs標準品:具體內容詳見表1，德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、醋酸、四氫呋喃、正己烷(色譜純)，銅粉(分析純)國藥集團化學試劑有限公司;環庚三烯酚酮(分析純)上海紫一試劑廠;實驗用水 均為實驗室自制二次蒸餾水;樣品(含魚類、貝類、蝦類、蟹類)均購自舟山市海產批發市場，共計12個樣品，用潔凈的食品級聚乙烯塑料袋裹住樣品后，立即用專用便攜冷藏裝置送至實驗室。

7890B/5977A氣相色譜－質譜儀 美國Agilent公司;VS22－500A超聲波萃取儀 無錫沃信儀器制造有限公司;Vortex4型渦旋振蕩器 德國IKA公司;SIGMA 8KS高速離心機 德國Sigma公司;ChristALPHA 1－2 LD plus冷凍干燥機 美國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 9種OTs標準儲備溶液(1000μg/L):加入甲醇溶液進行配制，逐次稀釋后用甲醇定容，配出1000μg/L的混標溶液，在4℃的溫度條件下儲放。

1.2.2 樣品制樣和保存 制樣時，將魚類樣品去除其外皮和鱗片，沿著其脊背取下肌肉部分;將蝦類和蟹類樣品去除其頭部、外殼和附肢部分，取其肌肉部分;將貝類樣品去除殼部，只取其可食用部分。樣品切為長寬高均不大于0.5 cm的大小，用樣品組織研磨機勻質后在－55℃冷凝器溫度下冷凍干燥12 h(同時測定其含水率，便于最后實際樣品測定濃度也可以按濕重計)，取出后置于－18℃溫度條件下冷凍保存，待測。

1.2.3 樣品前處理 精確稱量1.2.2中1.00 g待測的樣品于50 mL離心管中，添加5 mL含0.03%環庚三烯酚酮的醋酸∶甲醇(1∶9，v/v)，經渦旋振蕩2 min后，以300 W功率在35℃的條件下連續超聲提取15 min，添加1～3 g銅粉進行脫硫，3000 r/min轉速下離心5 min，取其上清液，再向樣品中添加5 mL含0.03%環庚三烯酚酮的醋酸∶甲醇(1∶9，v/v)，重復如上操作后，將提取液收集于15 mL離心管后置于－80℃，冷凍脫脂2 h后，6000 r/min轉速下離心5 min，取出上清液到另一支15 mL離心管，再添入100 mg PSA固相吸附劑，渦旋振蕩1 min后，轉速6000 r/min下離心2 min，再取上清液到另一支50 mL離心管，添入40 mL醋酸－醋酸鈉緩沖溶液(1 mol/L，pH4.5～5)、1 g氯化鈉、5 mL正己烷后，渦旋振蕩后添入200μL含四乙基硼化鈉(10%)的四氫呋喃，振蕩15 min后，6000 r/min的轉速下離心2 min，取出上層的正己烷相，并在正己烷相中添加200 mg用于脫水的無水硫酸鈉、100 mg GCB固相吸附劑，渦旋1 min，取上清液通過0.22μm的濾膜，最后在溫度38℃的水浴下，吹氮氣蒸發到干，用正己烷進行溶解，最后定容到200μL，用GC－MS進行分析。

表1 9種OTs保留時間、定量離子、定性離子Table 1 Retention times，quantitative ions，and qualifier ions of 9 OTs

1.2.4 色譜條件 HP－35MS毛細管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);載氣為高純氦氣(純度99.999%)，流量1.0 mL/min;進樣口溫度260℃。進樣方式:不分流進樣，進樣1μL;傳輸線溫度260℃。柱升溫程序:初始溫度60℃，保持1.0 min，以20℃/min升溫至220℃，保持10 min，最后以15℃/min升溫至280℃，保持5.0 min，總運行時間28 min。

1.2.5 質譜條件 離子源配置為電子轟擊(EI)，溫度為230℃，電離能量為70 eV;溶劑延遲時間為3 min;四極桿溫度為150℃，選擇離子SIM監測;離子定量定性信息詳見表1。

2 結果與分析

2.1 萃取方式的選擇

由于索氏提取、振蕩提取等常用方法在萃取時耗費時間和人力，同時會用到許多對環境和人體有害的試劑。快速溶劑萃取和微波萃取法所需儀器設備價格較高。超聲波萃取法不僅能夠萃取出結構較為穩定的OTs，同時還具有高效、儀器設備低廉、試驗步驟簡捷等長處，目前已有一些研究運用該法來萃取海產品中的有機錫［15，18，26］。綜上，本次研究決定對海產品的OTs采取超聲波萃取法。有機錫檢測中常用的萃取劑有正己烷［27］、甲醇［28］、鹽酸－甲醇(v/v，1∶1)［10］、醋酸－甲醇(v/v，1∶1)［16］、二氯甲烷［29］、正己烷－環庚三烯酚酮［30］等。在萃取劑中添加二乙基二硫基代氨基甲酸鈉(NaDDTC)［31］、環庚三烯酚酮［25］等常見的螯合劑，可以通過提升OTs在有機相中的溶解能力來提高超聲波萃取的效率。采用含環庚三烯酚酮的有機溶劑萃取OTs時可提高目標化合物的溶解能力［32］，提高其萃取效率，且環庚三烯酚酮在0.01～0.5 g/100 mL的范圍內萃取效率并無明顯差異。本方法最終選擇含0.03%環庚三烯酚酮的醋酸∶甲醇(1∶9，v/v)溶液作為萃取劑。

2.2 凈化方式的選擇

色素和油脂是影響檢測海產品有機錫化合物的主要雜質。采取凝膠滲透色譜和固相萃取小柱/層析柱聯合凈化是已有報道研究常用的凈化方式。本研究首次采用冷凍脫脂和衍生前后各進行一次分散固相萃取進行凈化，凈化效果較為顯著。其中冷凍脫脂技術相對簡捷，無需使用額外試劑及凝膠滲透色譜等大型儀器設備，且能除去相當一部分脂肪，為后續進行兩次分散固相萃取凈化奠定基礎。使用PSA固相吸附劑能去除干擾OTs檢測結果的脂肪酸、碳水化合物、糖類、酚類和部分極性色素的不利因子［33］，所以在衍生和反萃取之前，首先選擇PSA固相吸附劑進行分散固相萃取凈化。而衍生后進行第二次分散固相萃取凈化時，比較了C18、PSA、GCB等固相吸附劑的分散固相萃取凈化效果(圖1)，結果顯示運用GCB進行吸附后提取液基本呈無色透明，9種OTs的回收率較高(75.4%～118.2%)。因此本研究采用GCB作為第二次分散固相萃取凈化的吸附劑。

圖1 不同吸附劑對萃取效果的影響Fig.1 The effect of different adsorbents on extraction efficiency

2.3 衍生條件的選擇

使用GC法檢測OTs時通常要進行衍生。有機錫的衍生主要包括使用Grignard試劑(含鹵化鎂的有機金屬化合物)或烷基硼酸鹽(通常是NaBEt4)進行烷基化或使用硼氫化物(如硼氫化鈉NaBH4)進行轉換。NaBEt4由于其在水相基質中的應用以及具有在線和離線狀態下均能同時進行衍生和提取的功能［34］，不需要分解多余的衍生試劑且生成物比較穩定，是最被常用到的試劑。而Grignard試劑因其需要較為專業的處理技術和干燥條件來避免與水、酸、酮和醇發生反應影響檢測結果，很少用于有機錫的衍生。NaBH4劇烈的氫化衍生反應中會有氣泡產生，會帶走氫化后的OTs，重現性不理想，NaBEt4的衍生就較為簡單，在水相中就能把有機錫轉化為其乙基衍生物。然而衍生過程中必須調節pH(pH4～6)，使乙基可以親核取代有機錫陽離子。NaBH4可能會受到復雜的基質(如生物和沉積物)的干擾，主要源自與金屬的反應和金屬硼化物的生成(抑制生成Sn H鍵)［31］。通過比較目前國內外的衍生方法優劣，最終本研究選用NaBEt4作為衍生試劑。

表2 線性范圍、線性回歸方程，相關系數和檢出限Table 2 Linear regression equation，correlation coefficient and detection limit

2.4 標準曲線和檢出限

按1.2實驗方法所示對10、20、50、200、500、1000μg/L的OTs混合標準溶液衍生后進行GC－MS測定，將9種OTs的質量濃度作為橫坐標，將對應的定量離子積分峰面積作為縱坐標，繪制后得到標準曲線，在10～1000μg/L范圍里9種OTs的質量濃度與對應的峰面積呈線性，相關系數在0.9952～0.9988之間，檢出限(3S/N)為0.4～1.0μg/kg(干重dw，以Sn計)。依照3倍的信噪比得到9種OTs的檢出限，10倍信噪比計算定量限，詳見表2。經GC－MS分析后總離子流色譜圖如圖2。

圖2 混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of a mixed standard solution

2.5 方法的精密度和回收試驗

稱取1.00 g小黃魚樣品，同一樣品重復測定5次作為平行，結果如表3，同時對小黃魚樣品進行低(2μg/kg)、中(20μg/kg)和高(200μg/kg)3個濃度水平的加標回收試驗，同樣平行測定5次，結果如表3。樣品含量均以Sn計。

從表3得出，3種加標濃度下加標回收率為81.2%～115.0%，相對標準偏差為4.1%～7.5%之間，其中在2μg/kg低濃度加標水平下回收率為96.4%～115.0%，相對標準偏差為4.1%～7.5%，在20μg/kg中濃度加標水平下回收率為81.2%～101.8%，相對標準偏差為4.1%～6.5%，在200μg/kg高濃度加標水平下回收率為83.2%～100.9%，相對標準偏差為4.2%～6.2%。結果表明在3種不同的加標濃度下樣品加標均有較好的回收率，相對標準偏差也在較小的范圍內，測定結果的精密度、準確度都滿足要求。

表3 精密度和回收試驗結果(n=5)Table 3 Precision and recovery test results(n=5)

表4 樣品分析結果(濕重，以Sn計，μg/kg)Table 4 Sample analysis results(wet weight，in terms of Sn，μg/kg)

2.6 樣品分析

按照試驗方法分別對市售的龍頭魚、梅童魚、小黃魚、大黃魚、帶魚、鯧魚、海鰻、哈氏仿對蝦、口蝦蛄、梭子蟹、縊蟶、牡蠣等海產品中OTs進行檢測，結果表明，梅童魚、小黃魚、大黃魚、海鰻中均未檢出9種OTs。在龍頭魚、帶魚、鯧魚、哈氏仿對蝦、口蝦蛄、梭子蟹、縊蟶、牡蠣中，除MOT、TeBT、DOT未檢出外，其余OTs均有被檢出，9種OTs總量為ND～162.0μg/kg(ww，以Sn計)。其中貝類中苯基錫(5.8～89.4μg/kg)的含量均高于丁基錫(ND～0.6μg/kg)、辛基錫(ND)，也高于除鯧魚(13.0～22.1μg/kg)外的所有魚類(ND～14.2μg/kg)和甲殼類(ND～3.3μg/kg)樣品，說明貝類較魚類和甲殼類更易富集苯基錫，也許是因為軟體動物攜有稍強的產生金屬結合蛋白的本領［35］。由此可見，舟山市沿海的海產品已存在有機錫污染現象，尤其是TPhT的污染最為嚴重，需引起消費者注意。

3 結論

本文建立了超聲波萃取，冷凍脫脂，衍生前后分別進行分散固相萃取凈化，氣相色譜質譜法測定海產品的OTs的檢測方法。在優化條件下，9種有機錫化合物的線性范圍為10～1000μg/L，檢出限(3S/N)為0.4～1.0μg/kg(dw，以Sn計)。在2.00、20.0和200μg/kg 3個添加水平的回收率為81.2%～115.0%，相對標準偏差為4.1%～7.5%(n=5)。該方法相比凝膠滲透色譜、固相萃取凈化等有機溶劑消耗量大，耗時較長等缺點，大大提高了檢測速度。另外，根據舟山市售海產品中OTs檢測結果，龍頭魚、帶魚、鯧魚、哈氏仿對蝦、口蝦蛄、梭子蟹、縊蟶、牡蠣中9種OTs總量為ND～162.0μg/kg(ww，以Sn計)，說明海產品已存在一定水平的有機錫污染，應當引發相關部門和消費者的重視。下一步應開發新型的萃取凈化的方法，使前處理過程更加簡便高效，同時根據有機錫化合物的特性開發更多分析技術用于檢測不同形態的有機錫化合物，從而提高對海產品中各類有機錫化合物的監測水平，保障消費者的食品安全需求。