雞、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺間接競爭ELISA檢測方法研究

崔乃元，劉怡菲，王 萍，武俠均，劉 薇，邢維維，馬立才，*

(1.北京維德維康生物技術有限公司，北京100095;2.河北省獸藥監察所，河北石家莊050051)

金剛烷胺(Amantadine，AMD)、金剛乙胺(Rimantadine)和索金剛胺(Soramantadine)均屬于金剛烷胺類藥物(結構式見圖1)，是一類抗病毒藥物［1］，也可以有效緩解帕金森病患者的癥狀［2］。早期應用于抑制人類流感病毒，具有價格低廉、藥效明顯等特點，對于流感的預防和治療效果較好，該類藥物在禽類流感的治療上也得到了廣泛的應用，但是禽類體內過量殘留的金剛烷胺類藥物會對其神經系統產生較大危害。2012年的“速成雞”事件中檢測出雞肉中殘留有金剛烷胺類等抗病毒藥物，給我國家禽類養殖業帶來嚴重的負面影響［3］。該藥物的濫用不僅會造成雞肉風味和品質下降，還會導致病毒抗藥性與藥物殘留的產生，然后通過食物鏈影響消費者健康［4］。

圖1 金剛烷胺類藥物化學結構式Fig.1 Chemical structural formula of amantadines

美國FDA于2006年禁止金剛烷胺類抗流感病毒藥物用于禽類［5］，我國農業部2005年在《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》要求禁止生產、經營和使用金剛烷胺等抗病毒藥物［4，6－7］。因此，為確保動物源性食品的安全和對外出口貿易的發展，建立準確可靠，靈敏度高的禽肉中金剛烷胺類藥物的定性定量檢測方法是十分必要的。

已有文獻報道的金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺的檢測方法可分為物理化學法和免疫化學法。前者包括高效液相色譜法［8］、液相色譜－質譜聯用法(HPLC－MS)［9－11］、親水相互作用色譜－串聯質譜法［12］等。后者主要包括酶聯免疫吸附法［13－18］、免疫層析法［15－16，19］、免疫比色分析［20－21］等。色譜方法雖然準確度高，但前處理復雜且檢測成本高，不適合高通量快速篩選。酶聯免疫分析法是一種易操作、速度快、成本低廉且檢測通量高的檢測方法，被廣泛應用于食品安全檢測中［22－26］。Wu等［16］建立了金剛烷胺間接競爭ELISA快速定量檢測方法，其IC50為11.93 ng/mL，檢測限為1.18 ng/mL，線性范圍為2.5～100 ng/mL;使用ELISA方法檢測金剛烷胺殘留的報道很多［27－28］，但檢測雞肉、鴨肉中金剛烷胺類藥物(金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺)的研究甚少。

本研究設計并合成了一種新型的金剛烷胺抗原，通過免疫動物獲得了金剛烷胺特異性抗體，進而建立了一種檢測雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺的殘留量的間接競爭ELISA分析方法，該方法具有靈敏度高、特異性強的特點，為禽肉中金剛烷胺類藥物的檢測和監管提供一種重要的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、辣根過氧化物酶(HRP)、高碘酸鈉(NaIO4)、碳酸鈉(Na2CO3)、硼氫化鈉(NaBH4)、硫酸銨((NH4)2SO4)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)購自美國Amresco公司;金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等藥物 購自Sigma公司;6～8周齡Balb/c(巴比賽)雌鼠、SP2/0小鼠骨髓瘤細胞 北京維德維康生物技術有限公司制備;雞肉、鴨肉樣品 購自于北京市海淀區的上莊水鄉農貿市場和前沙澗農貿市場及物美溫泉品超市，每個農貿市場/超市分別購買雞肉、鴨肉各10份，共60份樣品。

微量移液器 德國Eppendorf公司;ES120電子天平 天津德安特傳感技術有限公司;Sorvall ST 8冷凍離心機 德國Thermo Fisher Scientific;KQ－100E超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;TSQ Fortis液相色譜－串聯質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;MK3酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;N－EVAP氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 包被緩沖液:pH9.6，0.05 mo1/L的碳酸鈉緩沖液;封閉液:每1 L封閉液按照如下方法配制:將5 mL馬血清、1 g疊氮化鈉、30 g酪蛋白混合，用磷酸鹽緩沖液(PBS濃度為0.02 mol/L，pH為7.2)溶解并定容至1000 mL;底物顯色液:由A液和B液組成，A液為2%過氧化脲的水溶液，B液為1%四甲基聯苯胺(TMB)的水溶液;終止液:0.2 mol/L硫酸水溶液;濃縮洗滌液:將10 mL吐溫－20、5 g疊氮化鈉和990 mL磷酸鹽緩沖液混合。

1.2.2 金剛烷胺半抗原的制備 稱取0.94 g金剛烷胺鹽酸鹽溶于30 mL無水吡啶，加入馬來酸酐(MAH)0.49 g，溶解后，加入4－二甲氨基吡啶10 mg，70℃回流反應3 h，旋蒸除去吡啶，加去離子水10 mL，冰醋酸調pH5.0，析出大量沉淀，過濾，水洗沉淀，干燥后得半抗原AMD－MAH。

1.2.3 免疫原和包被原的制備 稱取5.57 mg半抗原溶于1 mL N，N－二甲基甲酰胺(DMF)，加入碳化二亞胺(EDC)4.3 mg，N－羥基琥珀酰亞胺(NHS)5.2 mg，室溫攪拌反應2 h;50 mg BSA溶于5 mL 0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液，將上述活化藥物逐滴加入到5 mL含有1%BSA(包被原:1%OVA)的碳酸氫鈉緩沖溶液中(0.1 mol/L)，室溫攪拌過夜，PBS 4℃透析72 h，期間換透析液6次，即得到免疫原AMD－MAH－BSA和包被原AMD－MAH－OVA。將透析液在無菌條件下過0.22μm孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，－20℃保存。采用MALDI－TOF/MS對所合成免疫原的偶聯比進行測定［29］。

1.2.4 單克隆抗體的制備 用上述制備出的免疫原按100μg/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6～8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28 d以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫1次，融合前3 d以免疫復合物100μg/只，不加弗氏佐劑再追加免疫1次。將免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)混合，然后于37℃、5%CO2培養箱中培養，5 d后用HT培養基半換液，9 d時進行全換液。全換液后采用間接ELISA方法，選擇和標記效價高、抑制率高的陽性雜交瘤細胞。若經金剛烷胺阻斷后的OD450nm值下降到對照孔的50%以下，則判為陽性，經2～3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進行亞克隆化。將2～3次亞克隆建株后的雜交瘤細胞擴大培養，收集上清液用間接ELISA測定效價，凍存;并將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔，制備腹水，測定效價，并－20℃凍存備用。

1.2.5 特異性 選擇與金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺具有類似結構或功能的幾種藥物美金剛胺、氧氟沙星、環丙沙星進行ELISA測定，通過各種藥物的標準曲線分別得到其IC50，根據公式:

式中:IC50(金剛烷胺)為引起50%抑制的金剛烷胺濃度(μg/kg)，IC50(類似物)為引起50%抑制的結構類似物濃度(μg/kg)

1.2.6 ic－ELISA 包被AMD－MAH－OVA的聚苯乙烯酶標板:用0.05 mol/L的碳酸鹽溶液將抗原稀釋至2.5μg/mL，包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100μL，37℃溫育2 h，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次10 s，拍干，然后在每孔中加入150μL封閉液，37℃溫育2 h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。競爭反應:加入50μL金剛烷胺類標準品或樣品溶液;然后在每孔中加入50μL酶標抗體工作液;蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10 s，充分混勻，室溫下(25±2)℃，避光反應30 min;揭開蓋板膜;倒掉板孔中液體，在每孔加260μL洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡15～30 s;倒掉板孔中液體，將酶標板倒置于吸水紙上，拍干;立即在每孔中加入100μL A、B混合液;蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10 s，充分混勻，室溫下(25±2)℃，避光反應15～20 min;揭開蓋板膜，在每孔中加入50μL終止液，輕輕振蕩酶標板10 s，充分混勻;終止后5 min內用酶標儀在雙波長450、630 nm下讀取酶標板吸光度［30］。

1.2.7 樣品前處理方法 準確稱取(3±0.05)g均質后的雞肉、鴨肉樣品于50 mL離心管中;加入6 mL酸化乙腈(含1%乙酸)，充分渦動5 min;室溫(25±2℃)下4000×g離心5 min;取3 mL上清液40～50℃水浴氮氣吹干;加入2 mL正己烷充分渦動30 s，再加入1.0 mL 10 mmol/L PB(含1%BSA，0.5%Tween－20，1%蔗糖)，充分渦動30 s;4000×g以上離心5 min;棄去上層正己烷及中間層雜質;取50μL進行檢測。

1.2.8 準確度和精密度分析 向均質后的雞肉、鴨肉空白樣品中添加梯度濃度的金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺溶液，使其終濃度分別為1和2μg/kg，將每個濃度梯度添加3個平行;然后按照1.2.6進行前處理和檢測，利用平均值計算添加回收率，公式如下:

添加回收率(%)=檢測值/添加值×100

上述實驗在不同工作日內重復3次，分別統計日內變異系數和日間變異系數。

1.2.9 與儀器方法比較 取雞肉和鴨肉樣品各25份，同時使用本研究所建立的icELISA方法和GB 31660.5－2019《動物性食品中金剛烷胺殘留量的測定》液相色譜－串聯質譜法［31］進行檢測，以評價方法的可靠性。

1.3 數據處理

在標準曲線制作過程中，以樣本中添加的金剛烷胺質量濃度(μg/kg)的自然對數值為X軸，吸光度OD值為Y軸，采用Origin 8.0軟件擬合四參數競爭標準曲線。

2 結果與分析

2.1 半抗原合成的鑒定

采用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜法(MALDI－TOF－MS)鑒定免疫原(AMD－MAH－BSA)的結果如圖2和圖3所示。載體蛋白BSA的分子質量為67485.901，AMD－MAH－BSA經MALDI－TOFMS測定的分子質量為73828.009。經計算可知，半抗原AMD－MAH與BSA的偶聯比為25.40。

圖2 BSA的MALDI－TOF－MS圖譜Fig.2 MALDI－TOF－MSspectrum of BSA

圖3 AMD－CMO－BSA的MALDI－TOF－MS圖譜Fig.3 MALDI－TOF－MSspectrum of AMD－CMO－BSA

金剛烷胺半抗原結構如表1所示。Wu等［16］直接采用戊二醛的醛基與金剛烷胺和載體蛋白氨基縮合成Schiff堿而進行共價交聯合成金剛烷胺全抗原，檢測方法的IC50為11.93μg/L。Peng等［13］加入丁二酸酐與金剛烷胺氨基結合生成酰胺作為金剛烷胺半抗原，測得其檢測方法的IC50為15.8μg/L。與本文所建立的ic－ELISA方法相比，上述兩種方法所制備的抗體靈敏度均較低，這可能因為其半抗原分子極性低不利于產生高親和力的抗體導致的。

由于金剛烷胺烷烴分子間作用力少，不利于產生抗體，因此本研究通過引入馬來酸酐作為碳鏈，使電子云密度加大有利于金剛烷胺產生抗體。同時最大限度的保留了金剛烷胺的結構，以利于產生具有高特異性的抗體。

2.2 特異性

用建立的方法對緩沖體系中金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺及其他臨床常用藥物進行測試，本研究所制備單克隆抗體的靈敏度和交叉反應率如表2所示。金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺的IC50依次為0.316、0.136和0.131 μg/kg，但 是 與 美 金 剛 胺(＜1%)、氧氟沙星(＜0.1%)和環丙沙星(＜0.1%)的交叉反應率均較低。由此可見，本研究所制備的單克隆抗體具有良好的靈敏度和特異性。

表1 金剛烷胺半抗原結構對比Table 1 Comparison of the haptens structure for determination of AMA

表2 用間接競爭ELISA測得金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺交叉反應率Table 2 Cross reaction rate of amantadine，amantadine and soamantadine measured by indirect competitive ELISA

2.3 標準曲線的建立

分別取雞肉和鴨肉樣本，向其中添加金剛烷胺標準溶液使其質量濃度分別為(0、0.1、0.3、0.9、2.7和8.1μg/kg)，按照1.2.6和1.2.7節所述進行樣本前處理及分析檢測，并依據1.3節擬合標準曲線(圖4)。結果顯示，其曲線回歸方程為:雞肉:Y=0.071+(2.336－0.071)/(1+(x/0.333)1.257)，線性決定系數R2為0.9958，線性范圍為0.603μg/kg～3.104μg/kg;鴨肉:Y=－0.487+(2.039+0.487)/(1+(x/0.878)0.499)，線性決定系數R2為0.9990，線性范圍為0.592～6.311μg/kg。

2.4 檢測限和定量限

按照農業部規定的方法［32］:分別測定20份空白雞肉、鴨肉樣品，取其平均值，加上3倍標準差來確定試劑盒的最低檢測限，加上10倍標準差來確定試劑盒的定量限。具體數據如表3所示，金剛烷胺、金剛乙 胺、索 金 剛 胺 的 檢 測 限 分 別 為:0.57、0.42、0.41μg/kg(雞肉)和0.59、0.40、0.38μg/kg(鴨肉);定量限分別為0.85、0.63、0.69μg/kg(雞肉)和0.94、0.68、0.52μg/kg(鴨肉)。

圖4 ic－ELISA檢測金剛烷胺類的標準曲線Fig.4 Standard curve for detection of amantadine by ic－ELISA

2.5 準確度和精密度

在3個批次的雞肉、鴨肉樣品中依次添加終濃度為1、2μg/kg金剛烷胺標準物質進行添加回收測定。結果如表4所示，本方法雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺的回收率為67.0%～117.9%;日內變異系數在6.3%～12.7%，日間變異系數在8.1%～14.5%之間，均小于15%，表明該方法具有較好的準確度和精密度。

2.6 與國標方法比較

為了驗證酶聯免疫法在實際工作中對真實樣品中金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺測定的準確性，采用本方法與HPLC－MS［30］方法分別對25份雞肉和25份鴨肉盲樣進行測定，比較測定結果。由表5可知，兩種方法檢測雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺殘留的結果一致性較高，與儀器方法相比，本文建立的ic－ELISA方法具有靈敏度高，檢測時間短，穩定性好等優點，可應用于批量樣本的快速篩查，具有良好的實際應用價值。

3 結論

綜上所述，本文采用ic－ELISA技術建立了一種檢測雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺殘留的方法，其金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺的檢測限分別為:0.57、0.42、0.41μg/kg(雞肉)和0.59、0.40、0.38μg/kg(鴨 肉);定 量 限 分 別 為0.85、0.63、0.69μg/kg(雞肉)和0.94、0.68、0.52μg/kg(鴨肉)，而且與其他幾種臨床常用藥物交叉反應率低，說明方法具有良好的特異性。雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺的添加回收率在67.0%～117.9%之間;日內變異系數為6.3%～12.7%，日間變異系數為8.1%～14.5%，均小于15%，且實際樣品檢測結果與HPLC－MS一致性較高(R2=0.9990)。由此表明，本研究所建立的檢測雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺殘留的icELISA測定方法具有靈敏，準確精密的特點，具有較高的實際應用價值。

表3 金剛烷胺類藥物檢出限和定量限驗證(n=20)Table 3 Verification of detection and quantitation limits for amantadines(n=20)

表4 日內、日間變異系數Table 4 Intra－and inter－day coefficient of variation

表5 檢測金剛烷胺與儀器方法比較結果(μg/kg)aTable 5 Comparison results with instrument methods(μg/kg)