針刀療法對肩周炎模型兔局部組織IL-1β、TNF-α和ASIC1表達的影響

周丹,張照慶,尹晶,王小飛,金瑋,武歡

(1.湖北中醫藥大學,武漢 430061;2.武漢市第三醫院,武漢 430061)

肩關節周圍炎簡稱肩周炎,以活動時肩部疼痛及活動受限、功能障礙為主要臨床表現,嚴重影響患者生活質量,多見于50歲左右的成人,又稱“五十肩”“肩凝證”“漏肩風”[1]。目前對肩周炎的臨床癥狀及相應的治療方法研究頗多,但肩周炎發生的病因及病理機制尚不明確,且臨床上對該病有效治療方案尚無共識[2-3]。大量臨床研究[4-7]證實,針刀療法治療肩周炎具有臨床療效顯著、適用廣泛且費用較低的特點[8-9]。通過動物模型探索肩周炎發病機制及針刀療效的分子機制,有助于為肩周炎臨床治療方案的發展提供思路,然而目前相關研究較少。白介素(interleukin, IL)-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α為促炎性細胞因子,與炎癥發生、組織損傷和充血水腫有關;酸敏感離子通道 1(acid-sensing ion channel 1,ASIC1)則通過調節痛覺感受神經元的功能,導致牽涉痛和機械性痛覺產生[10]。本研究通過觀察針刀松解法對肩周炎家兔模型局部組織形態學和病理學改變以及IL-1β、TNF-α和 ASIC1表達水平的影響,探索針刀療法對肩周炎干預作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級健康雄性新西蘭兔 30只,體質量(2.5±0.5)kg,購于武漢市萬千佳興生物科技有限公司,動物使用許可證號為 SCXK(鄂)2016-0011,動物實驗經武漢市第三醫院實驗動物倫理委員會審查通過(批件號為武三醫實倫SY2019-010)。家兔飼養于湖北中醫藥大學針灸骨傷學院實驗動物中心,飼養環境設置為室溫(23～25) ℃,相對濕度 50%～62%,光照強度和明暗交替時間按照 GB9425-2001標準執行。將 30只健康雄性新西蘭兔適應性飼養7 d后,按照隨機數字表法將家兔分為空白組、模型組、針刀組3組,每組10只。

1.2 主要試劑與儀器

一次性針刀(0.6 mm×40 mm,北京中研太和醫療器械有限公司,貨號 100PCS);蘇木素染液(美國 ASPEN,貨號 AS1055A)、伊紅染液(美國 ASPEN,貨號AS1094);TRIpure Total RNA Extraction(武漢 ELK,貨號 EP013),EntiLink? 1st Strand cDNA Synthesis Kit(武漢 ELK,貨號 EQ003),EnTurbo? SYBR Green PCR SuperMix(武漢ELK,貨號EQ001);基因擴增儀(杭州博日,型號 TC-XP);熒光定量 PCR儀(美國 Life technologies, 型號StepOne? Real-Time PCR System);IL-1β(北京 Bioss,貨號 bs-20448R)、TNF-α(美國 Abcam,貨號 ab6671)、ASIC1抗體(武漢ELK,貨號ES8643),羊抗兔HRP-二抗(美國ASPEN,貨號AS1107);SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(美國ASPEN,貨號AS1012),RIPA總蛋白裂解液(美國 ASPEN,貨號AS1004),BCA蛋白質濃度測定試劑盒(美國 ASPEN,貨號AS1086),ECL化學發光檢測試劑盒(美國ASPEN,貨號 AS1059),顯影定影液(美國 ASPEN,貨號AS1027);0.45μm PVDF 膜(美國 Millipore,貨號IPVH00010);柯達醫用 X射線膠片(日本 Kodak,貨號XBT-1);酶標儀(江蘇Diatek,型號DR-200Bs)。

1.3 模型制備與鑒定

空白組正常飼養,模型組及針刀組家兔右肩部外側脫毛,面積為6 cm×6 cm。家兔呈俯臥位,將其后肢和左前肢固定于兔臺,右前肢上臂固定于水平搖床。設置搖床搖動頻率為240次/min,振幅為1.5 cm,平行搖動家兔右肩關節,每天持續固定搖晃4 h,連續3 d。每日機械搖晃后即刻將自制冰袋放于家兔右肩部冰敷,冰敷時將兔固定于兔盒,并在冰塊融化時重復更換新冰袋,每天持續4 h[11]。連續3 d后觀察兔右前肢形態變化,當兔右前肢呈“外翻”狀態,運動受限,主動爬行時身體傾斜,并出現右肩關節活動不利、疼痛反應增強,并且局部軟組織均輕度腫脹,肉眼可見不同程度充血或瘀斑時,提示肩周炎模型兔造模成功[12]。

1.4 干預方法

空白組及模型組兔不接受任何干預手段,回籠繼續飼養。針刀組兔接受針刀治療,造模成功后第 2、8、15和22天,固定兔模型于兔臺,仔細觸診模型兔右肩關節,常規碘伏消毒,定位喙突外緣、岡上肌腱大結節和結節間溝處,針刀縱疏橫剝2刀,若附近區域觸及陽性反應點,則一并針刀松解2刀,以松為度[11]。快速出針刀,無菌紗布塊按壓1 min,防止出血,再次消毒后用無菌敷料貼扎。每周治療1次,共治療4周,隨后進行行為學觀察。

1.5 標本采集

用空氣栓塞法處死實驗兔后迅速剝取右側肩關節內滑膜組織,取下關節滑膜囊及周圍組織,在冰面上用0.9%生理鹽水漂洗干凈,取大小為2 cm×2 cm×0.3 cm關節滑膜囊組織,于20%多聚甲醛溶液中固定1周,用于病理組織切片 HE染色;另外取大小約 1 cm×1 cm關節滑膜囊及周圍組織,液氮速凍24 h后,在－80 ℃冰箱保存,用于RT-qPCR和Western blot檢測。

1.6 指標檢測

1.6.1 肩關節組織病理學觀察

將新鮮局部肩關節滑膜組織置于 4%多聚甲醛中固定 1周,組織從固定液取出后將目的部位組織修平整,經過脫水機內依次梯度乙醇脫水、包埋、切片、攤片機展平、石蠟切片脫蠟至水、蘇木素染細胞核、伊紅染細胞質以及脫水封片步驟后,采用光學顯微鏡觀察各組新西蘭兔右側肩關節囊滑膜肌組織病理形態。采用Image J 和Image Pro Plus v6.0圖像處理軟件分析圖片。

1.6.2 肩關節滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和ASIC1 mRNA檢測

采用無 RNA酶工具從液氮中取約 100 mg組織,于1 mL預冷的TRIpure溶液中充分研磨,勻漿液小心倒入 1.5 mL EP管中,加入 250 μL三氯甲烷溶液,充分混勻,冰上靜置5 min。在4 ℃下以12 000 r/min離心 10 min。于超凈工作臺中小心吸取上清 500 μL于1.5 mL EP管中,加入等體積4 ℃預冷的異丙醇溶液中,顛倒混勻,于－20 ℃冰箱靜置 15 min后離心,4 ℃,12 000 r/min,10 min,小心倒掉液體,加入 1 mL 4 ℃預冷 75%乙醇,顛倒數次,離心清洗 RNA沉淀,4 ℃,12 000 r/min,5 min,棄液體。將沉淀置于超凈工作臺干燥數分鐘后,加入10 μL RNase-Free水,充分溶解RNA。將RNA逆轉錄為cDNA,根據說明書設置總反應體系為20 μL,PCR儀設定為37 ℃ 60 min,85 ℃5 min,4 ℃。進行熒光定量 PCR,反應體系成分為2×Master Mix(5.0 μL),2.5 μM引物工作液(1.0 μL),Template(1.0 μL),ddH2O(2.0 μL)以及Rox(1.0 μL),引物序列見表 1。反應程序設置為預變性95 ℃,3 min;循環95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃30 s,40個循環;熔解曲線采用儀器默認設置。數據分析方法采用ΔΔCT法,即A＝CT(目的基因,實驗樣本)－CT(內標基因,實驗樣本),B＝CT(目的基因,對照樣本)－CT(內標基因,對照樣本),K=A－B,表達倍數=2﹣κ。

表1 各檢測指標引物序列

1.6.3 肩關節滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和 ASIC1蛋白檢測

組織塊用 PBS漂洗去除血污,剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的蛋白提取試劑,冰浴勻漿。4 ℃,12 000 r/min,離心 5 min,收集上清,即為總蛋白溶液。采用BCA法測定蛋白濃度,根據樣品濃度確定上樣量,保證每個樣品總蛋白上樣量均為 40μg。在蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃沸水浴5 min。配制分離膠、濃縮膠,按濃縮膠 80 V、分離膠120 V進行恒壓電泳。從正極到負極擺放轉膜“三明治”結構,擺放過程避免氣泡產生,設置300 mA恒流轉膜。將轉好的膜置于封閉液封閉,37 ℃,1 h。隨后除去封閉液,加入稀釋好的一抗(稀釋比例 IL-1β為1:500,TNF-α和 ASIC1為1:1000),4 ℃,孵育過夜,回收一抗,用TBST清洗3次,每次5 min。加入稀釋好的二抗(稀釋比例為 1:10 000),室溫下孵育 30 min,用TBST于搖床上清洗4次,每次5 min。滴加ECL溶液于膜上,暗室中進行曝光,顯影、定影。以GAPDH為內參測定IL-1β、TNF-α和ASIC1蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均值±標準差表示,根據數據是否符合方差齊性分別采用單因素方差分析(One Way-ANOVA)(組間比較采用Tukey檢驗)或非參數秩和檢驗(Kruskal-Wallistest)(組間比較采用Dunn’s檢驗)。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組肩關節周圍組織肉眼觀察

空白組家兔肩關節形態正常,未見腫脹,打開關節腔無積液。模型組家兔肩關節周圍組織充血腫脹明顯,周圍肌肉有肥厚、機化、粘連,打開關節腔時有大量黃色積液流出。針刀組家兔肩關節周圍組織腫脹情況、周圍肌肉肥厚和粘連情況較模型組輕,打開關節腔時僅有少量黃色積液流出。

2.2 3組肩關節周圍組織病理學改變

光鏡下觀察肩關節周圍組織HE染色切片,空白組滑膜細胞結構疏松,可見少量毛細血管,肌腱外膜上皮細胞和肌腱纖維排列整齊,無炎癥細胞浸潤;模型組滑 膜上皮層毛細血管增多,滑膜中有纖維素滲出并和周圍組織粘連,肌腱外膜上皮細胞增生且排列不整齊,肌纖維部分斷裂,肌間質中纖維素滲出、機化和結締組織增生,且肌間質中有紅細胞滲漏,未見明顯炎癥細胞浸潤;針刀組滑膜細胞排列同正常組,可見少量毛細血管,肌腱外膜上皮細胞輕微增生,肌腱纖維致密,排列整齊,未見明顯炎癥細胞浸潤。表明針刀療法可以改善肩周炎模型兔病理學改變。詳見圖1。

圖1 3組家兔肩關節周圍組織病理形態比較

2.3 3組肩關節滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和ASIC1 mRNA表達水平

與空白組比較,模型組家兔肩關節滑膜組織中IL-1β、TNF-α和 ASIC1 mRNA表達水平均顯著增加,差異具有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較,針刀組肩關節滑膜組織中IL-1β、TNF-α和 ASIC1 mRNA表達水平均顯著降低,差異具有統計學意義(P＜0.01);與空 白組比較,針刀組肩關節滑膜組織中 IL-1β和ASIC1 mRNA表達水平顯著增加,差異具有統計學意義(P＜0.01)。表明針刀療法可以顯著減少肩周炎模型兔IL-1β、TNF-α和和ASIC1的mRNA表達水平。詳見表2。

表2 3組家兔肩關節滑膜中 IL-1β、TNF-α和 ASIC1 mRNA表達水平(±s)

表2 3組家兔肩關節滑膜中 IL-1β、TNF-α和 ASIC1 mRNA表達水平(±s)

注:與空白組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別空白模型針刀別白組型組刀組n 10 10 10 1 2 1 IL-1β 1.03±0.247 2.93±0.4581)1.87±0.3391)2 1.3.2) 1.TNF-α 13±0.226 73±0.6781)81±0.2442)AS 1.03±3.27±2.11±SIC1±0.312±0.2401)±0.1561)2)

2.4 3組肩關節滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和 ASIC1蛋白表達水平

與空白組比較,模型組家兔肩關節滑膜組織中IL-1β、TNF-α和 ASIC1蛋白表達水平均顯著增加,差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較,針刀組肩關節滑膜組織中 TNF-α和和ASIC1蛋白表達水平均顯著降低,差異有統計學意義(P＜0.01);與空白組比較,針刀組肩關節滑膜組織中TNF-α和 ASIC1蛋白表達水平均顯著增加,差異有統計學意義(P＜0.01)。表明針刀療法可以顯著減少肩周炎模型兔 IL-1β、TNF-α和ASIC1的蛋白表達水平。詳見圖2、表3。

圖2 3組肩關節滑膜組織中IL-1β、TNF-α和 ASIC1蛋白條帶圖

表3 3組肩關節滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和ASIC1蛋白表達水平(±s)

表3 3組肩關節滑膜組織中 IL-1β、TNF-α和ASIC1蛋白表達水平(±s)

注:與空白組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別空白模型針刀別白組型組刀組n 10 10 10 IL-1β 1.00±0.05 5.85±0.151)2.53±0.14 1.4.1.TNF-α 00±0.17 13±0.181)79±0.221)2)AS 1.00±0.15 6.27 3.07 SIC1±0.281)±0.711)2)

3 討論

肩周炎是軟組織退行性與炎癥性病變,其基本病因是肩關節周圍軟組織的廣泛粘連、瘢痕和無菌性炎癥。針刀能夠對肩關節周圍的肌腱韌帶等軟組織的粘連、攣縮和瘢痕等進行橫向剝離和縱向疏通,其作用機制包括松解粘連,改善循環,解除粘連和機化瘢痕對感覺神經末梢的牽拉、機械性壓迫等[13]。從中醫學角度來講,“痛則不通,通則不痛”,小針刀療法將針刺療法的“針”和手術療法的“刀”有效結合,通過針刀松解可以平衡陰陽、活血通氣、疏通經絡,達到松解肌肉痙攣、疏通氣血的效果,從而治療肩周炎[14]。

IL-1β和TNF-α是機體在組織損傷、感染或炎癥過程中釋放的關鍵細胞因子,具有廣泛的促炎活性,能夠活化中性粒細胞等炎癥細胞,誘導多種炎癥介質、趨化因子和超氧化物的釋放[15-16]。IL-1β和TNF-α可直接或間接作用于傷害性感受器,通過增加神經元和膠質細胞上P物質和前列腺素E2的表達水平參與外周敏化[17],因此在持續性疼痛或病理性疼痛中起到重要作用[18]。其中,IL-1β不僅可以直接作用于傷害感受器或通過間接作用,誘導其他傷害性分子釋放以促進炎癥反應,參與外周敏化[19],而且可以參與中樞水平的痛覺敏化[20],并且與嗎啡的耐受有關[21]。已有動物實驗研究發現,針刀干預可以降低肩周炎模型兔 IL-1β的表達水平[22]。ASICs屬于上皮細胞鈉通道/退化蛋白(epithelial Na﹢channel/degenerin, ENaC/DEG)超家族離子通道,是感覺神經元中酸的主要傳感器,在痛覺和機械感覺的傳導中起到關鍵作用[23]。無氧代謝誘導的乳酸和質子的累積會激活傷害性感受器,而ASICs的激活能夠敏化傷害性感受器[23]。當組織受傷或發炎時,背根神經節神經元中 ASIC1基因水平表達增加[24]。大量研究發現,肩周炎患者肩關節囊IL-1β和TNF-α等炎癥因子[25-27]以及 ASIC1[28]表達水平增加,因此這3個指標被認為是與肩周炎有關的生物標志物[29]。綜上所述,IL-1β、TNF-α和 ASIC1可能通過介導了炎性疼痛中的炎性痛敏反應,導致肩周炎炎癥和疼痛反應的發生。

本實驗結果表明,針刀療法可顯著改善肩周炎模型家兔肩關節滑膜組織病理學改變,降低 IL-1β、TNF-α和ASIC1基因與蛋白的表達水平。由此可推測,針刀松解術治療肩周炎的作用機制可能為,改善局部組織病理變化,促進組織的修復,減少肩關節滑膜組織中促炎因子IL-1β、TNF-α和酸感受器ASIC1的釋放,減輕局部組織炎癥反應和痛敏反應,通過抗炎鎮痛對肩周炎起到治療作用。

綜上所述,針刀療法治療肩周炎,可能是通過減少局部組織促炎因子釋放,起到消炎鎮痛的作用實現的。