采后菠蘿黑心病發病過程中酚類代謝的變化

常金梅，張魯斌

(1 嶺南師范學院，廣東湛江，524091；2 嘉應學院/廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室，廣東梅州，514000)

菠蘿黑心病亦被稱為菠蘿內部褐化病、小果心腐病、小果褐腐病等，是菠蘿主栽品種巴厘的主要采后病害之一[1]，常在采后貯藏和運輸過程中發生[2]。菠蘿黑心病發生時表現為果實外部無任何癥狀，橫剖后果心周圍果肉褐變，通常是小果基部或中部先出現半透明的水浸狀或淺褐色的小斑點，隨著發病程度的加深，褐色斑點互相聯結成一片，并向果髓發展，最終果髓甚至果肉都變為黑褐色，導致果實品質劣變，失去商品價值[3]，嚴重影響菠蘿產業和進出口貿易發展。該病害的生理機制尚不清楚。目前，國內外尚無有效控制黑心病的方法，因此，黑心病作為菠蘿產業最普遍最重要的問題倍受關注[4-5]。

酚類是植物抗病反應的主要生化物質，也是果實發生褐變的主要底物之一，是一類苯環上含有1個或多個羥基的芳香族衍生物，能夠被逆境的生物和非生物因子誘導合成[6-7]。植物體內的酚類物質代謝是一個錯綜復雜的過程[8]。菠蘿果實黑心病的發病機理復雜，其主要特征是褐變，本質是鄰苯二酚、表兒茶酚、兒茶酚和綠原酸被多酚氧化酶氧化為醌類物質，繼而通過非酶促聚合生成黑色素而使組織變成褐色[9]。另有研究表明，果實酶促褐變起主要作用的酶包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)等[10]。本研究主要針對采后菠蘿黑心病發病過程中總酚含量變化及其代謝相關酶活性變化進行系統研究，為明確菠蘿黑心病發生的生理機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

“巴厘”Ananascomosus(L.) Merr. cv. Comte de Paris，感病品種；“無刺卡因”Ananascomosusr(L.) Merr. cv. Cayenne，抗病品種。

1.2 方法

1.2.1 材料處理及取樣方法 將田間采收的七八成成熟、大小均勻、無機械損傷的“巴厘”和“無刺卡因”果實，保留頂芽，留果柄長1 cm，待田間熱散去，將菠蘿果實放入塑料框中，然后將塑料筐置于聚乙烯袋中，輕掩，常溫(25 ℃)貯藏，在果實黑心病發生過程中，及時拍照、取樣。

取樣方法：“無刺卡因”取果實中部距離果心1 cm處的果肉，“巴厘”菠蘿病健部分開取樣，健康部位指赤道部位距果皮0.5 cm的果肉，發病部位指果梗與果肉交接處。每處理重復 3 次，每次隨機取果實10個，將果肉切成小塊，液氮速凍，用高速粉碎機碾成粉末狀，做標記后于-80 ℃保存。

1.2.2 病情指數測定 果實黑心病分級：0級，無病斑；1級，病斑面積占果實面積的5%以下；3級，病斑面積占果實面積的6% ～25%；5級，病斑面積占果實面積的26% ～50%；7級，病斑面積占果實面積的50%以上。調查發病情況，計算病情指數。病情指數= ∑ (各級病果數×各級代表值) / (調查總果數×7)×100；

1.2.3 總酚的測定 參考徐輝艷等[11]的方法略作改動，取樣品1 g，加入80 ℃蒸餾水10 mL，80 ℃水浴40 min，期間搖動數次，取出冷卻后，過濾，定容至20 mL。以不同濃度沒食子酸標準品溶液繪制標準曲線，取濾液1 mL，加入水5 mL，福林酚試劑1 mL， 10%Na2CO33 mL，放置2 h，于765 nm下測吸光度值，重復3次，單位mg/g。

1.2.4 2，8-二羥甲基蒽醌的測定 參考金乾興等[12]的紫外分光光度法略作改動，取樣品1 g，加60%乙醇20 mL，80 ℃下超聲40 min，過濾，留濾液備用。以不同濃度的2，8-二羥基蒽醌標準品溶液繪制標準曲線，然后取濾液5 mL，用60%乙醇定容至10 mL，224 nm處測吸光度值，重復3次，單位mg/g。

1.2.5 酚類代謝相關酶活性的測定 PPO活性測定參考陳瑞琴等[13]的方法，POD、PAL、CAT活性測定參考劉曉陽等[14]的方法。

1.3 統計分析方法

數據應用軟件Microsoft Excel和SPSS 19.0進行處理和統計分析，采用Duncan′s法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 黑心病的發生情況

貯藏過程中，“巴厘”發生黑心病比較普遍，其黑心病在貯藏第4天開始零星發生；第6天時，發病率達到80%，病斑較小，病情指數15.24，之后病斑快速擴展；第10天時，發病率達到了100%，病情指數70，果實完全失去了食用價值(見圖1)；而“無刺卡因”在整個貯藏過程中均沒有發生黑心病。

圖1 常溫(25 ℃)貯藏下“巴厘”菠蘿果實黑心病發生情況

2.2 總酚含量變化

貯藏過程中，“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉總酚含量均無明顯的變化，“無刺卡因”果實總酚含量顯著高于“巴厘”。“巴厘”病部果肉中，總酚含量呈先上升后下降的趨勢，從貯藏第4天開始總酚含量開始快速上升，到第6天達到高峰，為0.41 mg/g，是健康部位的1.43倍；且在第4、6、8天時，其含量顯著高于“巴厘”健康部位，與黑心病發病時間相符(見圖2)。

2.3 2，8-二羥甲基蒽醌含量變化

“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉中2，8-二羥甲基蒽醌含量沒有明顯波動，但“無刺卡因”中其含量顯著高于“巴厘”。在“巴厘”發病部位，2，8-二羥甲基蒽醌含量從第4天開始增加，且顯著高于健康部位，第8天時為健康部位的2.34倍，之后略有下降(見圖2)。

圖2 常溫(25 ℃)貯藏下“巴厘”和“無刺卡因”菠蘿果實總酚和2，8-二羥甲基蒽醌含量變化

2.4 酚類代謝相關酶活性變化

在貯藏過程中，0～8 d時“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉PPO活性較穩定，且“巴厘”的PPO活性顯著高于“無刺卡因”，第10天時”巴厘”健康部位PPO活性也出現升高。“巴厘”發病部位果肉PPO活性從第6天開始升高，第8天達到最高值，為55.86 0.01A/min·FW，為健康部位的2.12倍，之后一直維持在較高水平。

在“無刺卡因”以及“巴厘”健康部位和發病部位，果肉過氧化物酶POD活性均呈下降趨勢，“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉POD活性均無顯著性差異；從第6天開始，“巴厘”發病部位果肉POD活性顯著低于健康部位，第10天時POD活性下降了92.57 0.01A/min·FW，而健康部位只下降了45.94 0.01A/min·FW，下降速度差異顯著。

整個貯藏過程中“無刺卡因”果肉CAT活性較低，最高只有1.18；“巴厘”菠蘿健康部位和發病部位果肉CAT活性均先上升后下降，但從第6天開始，發病部位果肉CAT活性顯著低于健康部位。

“無刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉PAL活性均呈現緩慢上升趨勢，且“無刺卡因”的PAL活性均顯著高于“巴厘”。“巴厘”發病部位PAL活性呈先上升后下降的趨勢，在第4天時達到最高值，為25.83 0.01A/min·FW，之后快速下降；到第10天時僅為11.83 0.01A/min·FW，顯著低于健康部位(見圖3)。

圖3 常溫(25 ℃)貯藏下“巴厘”和“無刺卡因”菠蘿果實酚類代謝相關酶活性變化

3 結論與討論

酚類化合物是植物體內重要的次生代謝物質，酚類物質及其氧化產物——醌的積累是植物對病原菌侵染和損傷的非專化性反應。反之，植物受到損傷時，必然也在一定程度上影響到植物體內原有的酚類代謝平衡[8]。本研究中，由于“巴厘”菠蘿在貯藏過程中黑心病發生比較普遍，因此分別取發病部位和健康部位做對比，并以抗黑心病的“無刺卡因”菠蘿作為對照進行研究。菠蘿發病部位果肉總酚含量變化顯著，從第4天開始含量顯著提高，一直到第6天達到峰值，這也是菠蘿果肉褐化加劇的時期。有研究表明，酚類物質是酶促反應褐化的底物[15-16]，因此酚類物質含量的提高，使褐化底物增加，在相關酶的作用下被氧化為醌類物質，醌類物質進一步聚合成黑色素，從而發生黑心病。之后，隨著病情的進一步加劇，總酚被逐步消耗，開始出現下降的趨勢。

酚類物質酶促氧化是果實褐變的關鍵，PPO、POD 和 PAL是影響果實褐變的關鍵酶[17]。PPO使酚類物質發生反應導致果實褐變，POD是果實褐變的保護酶，但在H2O2存在時也可通過催化酚類物質、類黃酮的氧化聚合導致果實褐變[18]。PAL是苯丙烷代謝途徑中酚類、植保素和木質素等抗菌物質合成的關鍵酶，一般認為PAL活性的增強對植物抗病是有利的。周玉嬋等研究認為PPO是菠蘿黑心病致病的關鍵酶，低溫和GA3處理可提高PPO和PAL的活性并增加PPO底物的含量，使酶促氧化反應更易進行，導致黑心病的發生[19]。本研究中，隨著果實黑心病發生，病部PPO活性顯著增強；“巴厘”健康部位和“無刺卡因”的果肉PPO活性則未出現明顯的變化，且前者一直高于后者，與“無刺卡因”一直沒有發生黑心病的現象相符，表明在菠蘿黑心病的發生過程中PPO發揮了重要的作用。對荔枝、冬瓜、龍眼、菊芋、中華壽桃等研究也表明PPO與酶促褐化有密切關系[20-24]；陳瑞琴、劉保華等研究還表明了PPO是引起荔枝果皮酶促褐變最主要的酶之一，PPO活性越高褐化越嚴重[13]。本研究結果也支持PPO與菠蘿酶促褐化有密切聯系，PPO活性越高黑心病發生越嚴重。有研究報道，許多植物在遭受機械傷害、寒冷、微生物侵染等不良環境時，植物體內的防衛系統特別是苯丙烷類被激活，體內PAL活性上升[25]。本研究結果顯示貯藏0～4 d時，患病部位PAL活性升高，第6天時出現快速下降，顯著低于健康部位，POD活性也在第6天出現了顯著下降，顯著低于健康部位，由此可推測POD和PAL在菠蘿貯藏過程中對黑心病的發生起抑制作用。本研究主要進行菠蘿黑心病發病過程中酚類物質含量及其代謝相關酶活性變化的研究，今后可以進行不同種類酚類組成和含量的測定與分析，深入探討褐變底物的差異對果實黑心病發生的影響。