吡拉西坦顆粒微生物限度檢查方法學驗證

王杰，劉澎浩邦，肖欽欽，章瑛，張春華，劉緒平

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330029

吡拉西坦是一種作用于中樞神經系統的腦代謝改善藥，屬于γ-氨基丁酸的環形衍生物。適應證為腦動脈硬化癥、腦血管意外等多種原因所致的記憶和思維功能減退，亦可用于老年精神衰退綜合征、老年性癡呆、兒童智力發育遲緩等［1-5］。藥品的微生物限度檢查在藥品質量控制和制劑安全性檢查方面至關重要［6-7］。根據 2015 年版《中國藥典》四部中1105、1106、1107 項下要求［8］，本實驗對吡拉西坦顆粒的微生物限度檢查法進行驗證，并進行微生物檢查，確保吡拉西坦顆粒微生物限度檢查符合要求。

1 儀器與材料

1.1 1 儀器

高壓蒸汽滅菌器（上海博迅實業），電子天平（北京賽多利斯），凈化工作臺（蘇州凈化有限公司），細菌培養箱（上海躍進），霉菌培養箱（上海一恒）。

1.2 材料

試藥：吡拉西坦顆粒（江西億友藥業有限公司，批號20180402、20180403、20180404，規格：5 g∶2.4 g），pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號200719，北京陸橋）。

培養基：麥康凱液體培養基（批號171103），胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號110422），胰酪大豆胨液體培養基（批號170112），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號170615），麥康凱瓊脂培養基（批號171114），沙氏葡萄糖液體培養基（批號170811），以上培養基均來自北京陸橋。

菌種：金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均來源于中國食品藥品檢定研究院，所用均為2 代菌株。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

按照《中國藥典》2015 年版四部通則1105 檢查項中的方法，將各試驗菌制成適宜濃度的菌液。

2.2 微生物限度檢查方法驗證

2.2.1 供試液制備1∶10 供試液 取吡拉西坦顆粒10 g，置無菌錐形瓶中，加入稀釋液（pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）至100 mL，振搖溶解，即得。

2.2.2 計數方法適用性試驗試驗組 取配制的1∶10的供試液5 份，每份9.9 mL，每份中加入試驗菌液0.1 mL，使供試液中含菌量不大于100 cfu/mL。取上述試液注入2 個平皿，使每個平皿1 mL，每個平皿加入胰酪大豆胨瓊脂培養基，再將平皿置33 ℃培養箱培養；取配制的1∶10 的供試液2 份，每份9.9 mL，每份中加入試驗菌液0.1 mL，使供試液中含菌量不大于100 cfu/mL。取上述試液注入2個平皿，使每個平皿1 mL，每個平皿加入沙氏葡萄糖瓊脂培養基，再將平皿置23 ℃培養箱培養。供試品對照組：稀釋液代替菌液，其他操作同試驗組。菌液對照組：以稀釋液替代供試液，其他操作同試驗組。

回收比值計算如下：回收比值=(試驗組菌落數-供試品對照組菌落數)/菌液對照組菌落數。計算結果見表1 與表2。可見，采用常規法，各實驗菌回收率均在0.5～2.0 的范圍內，表明該微生物限度檢查方法符合2015 年版《中國藥典》微生物限度檢查的驗證要求［9］。

表1 需氧菌總數驗證結果

表2 霉菌和酵母菌總數驗證結果

2.3 控制菌（大腸埃希菌）檢查

試驗組：取1∶10 的供試液10 mL，置錐形瓶中，加入胰酪大豆胨液體培養基100 mL，加入小于100 cfu 的大腸埃希菌液，置33 ℃培養箱培養24 h，取上述培養物1 mL，置加有100 mL 麥康凱液體培養基的無菌錐形瓶中，置42 ℃培養箱中培養48 h。用接種環取上述培養物通過劃線法，將其接種于麥康凱瓊脂平板上，置33 ℃培養箱中培養72 h，觀察結果。菌液對照組：以稀釋液代替供試品溶液，其它同試驗組。供試品組：以等量稀釋液替換菌液，其它和試驗組同法操作。稀釋液組：以等量稀釋液替換供試品溶液，并且不加菌液至錐形瓶中，其它和試驗組同法操作。

結果：試驗組和菌液對照組的麥康凱瓊脂平板上有大腸埃希菌生長，供試品對照組和陰性對照組的麥康凱瓊脂平板上均無菌生長。表明吡拉西坦顆粒在該條件下，對大腸埃希菌無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。說明可以采用該法進行吡拉西坦顆粒的大腸埃希菌檢查。

2.4 樣品微生物限度檢查

采用常規法對三批吡拉西坦顆粒進行需氧菌總數的檢查、霉菌和酵母菌總數及控制菌的檢查，結果見表3。結果表明，建立的檢查方法可用于吡拉西坦顆粒微生物限度的檢查。

表3 3批樣品微生物限度檢查結果

3 討論

在藥品的生產、包裝、運輸、存儲等環節中，一些外在的因素會造成微生物對藥品的污染，進而對人體造成各種危害［11］，藥品微生物限度檢查的過程中，檢驗環境以及檢測人員等都會對實驗結果產生影響，同時操作步驟較多，因此在考慮到吡拉西坦本身無抑菌性，因此用平皿法進行微生物檢查并進行方法學驗證，以減少可能造成的污染，從而確保檢驗方法的準確性［12］。

吡拉西坦是一種作用于中樞神經系統的腦代謝改善藥，屬于γ-氨基丁酸的環形衍生物，具有保護及修復腦細胞的作用，改善腦代謝，增加腦血流量，改善腦神經功能。結合其化學結構，初步判斷本品無抑菌性，為確保常規法配制的溶液不抑制實驗菌的生長，本研究對檢驗方法進行了回收率實驗，結果表明1∶10 的供試液各實驗菌回收比值均符合規定［10］。采用常規法作為本品的微生物的檢查方法是可行的。