HPLC法測(cè)定市售炮制輔料醋中川芎嗪的含量

董月梅 姜其寶 田金鳳 宋曉 張超

本文目的為測(cè)定不同品種市售炮制輔料醋中川芎嗪的含量。方法? 采用HPLC法測(cè)定市售醋中川芎嗪的含量，色譜條件為流動(dòng)相為甲醇-1%HAC（35：65），流速1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，進(jìn)樣量20?L。結(jié)果? 川芎嗪在0.29300?g·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=59.18X+127.16（r=0.9998），平均回收率為98.08%，RSD值為1.56%（n=6）。結(jié)論? 本研究建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性好、靈敏度高，適用于市售炮制輔料醋的質(zhì)量控制。

食醋中氨基酸的種類多達(dá)18種，具有促進(jìn)胃液分泌，降低血脂和膽固醇，延緩衰老等功能 [1]。近年來(lái)，炮制輔料用醋缺少嚴(yán)格的藥用標(biāo)準(zhǔn)，有文獻(xiàn)測(cè)定[2]食醋中苯乳酸的含量，為炮制輔料醋的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，還有文獻(xiàn)[3]用HPLC的方法測(cè)定了鎮(zhèn)江香醋中的川芎嗪，認(rèn)為川芎嗪主要是由微生物的發(fā)酵而產(chǎn)生的，美拉德反應(yīng)是川芎嗪含量增加的主要原因。但是，川芎嗪能否作為炮制輔料醋的質(zhì)量控制指標(biāo)未見(jiàn)報(bào)道。所以，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定13種市售炮制輔料醋中川芎嗪的含量，結(jié)合釀造原料和工藝分析結(jié)果，為炮制輔料用醋品種的選擇和藥用標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）; KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）;MS105DU型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;高速冷凍離心機(jī)（上海市浦東新區(qū)新金橋路27號(hào)7號(hào)樓），pH試紙（天津市金達(dá)化學(xué)試劑有限公司）。川芎嗪對(duì)照品（批號(hào)：110817-200305，中國(guó)藥品生物制品檢定所），其余試劑均為分析純。13種市售炮制輔料醋：山西紫林陳醋（批號(hào)：20200531）;紫林原釀陳醋（批號(hào)：20200629）;山西溢勺香老陳醋（批號(hào)：20150318）;恒順鎮(zhèn)江香醋（批號(hào)：20110928）;海天香醋（批號(hào)：20200705）;水塔老陳醋（批號(hào)：20200310）;恒順鎮(zhèn)江香醋（批號(hào)：20200415）;山西西堡泉老陳醋（批號(hào)：20130510）;居易米醋（批號(hào)：20200616）;正堂食醋（批號(hào)：20200227）;德馨齋清香米醋（20190610）;好太太香醋王（20200703）;海天白米醋（20200617）

方法與結(jié)果

對(duì)照品溶液的制備? 取川芎嗪對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為300?g·mL-1的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備? 精密量取食醋15mL，用10%的NaOH溶液調(diào)pH10-11，加入CHCL3 20mL，混勻萃取，靜置分層。7200r·min-1離心15min，轉(zhuǎn)移CHCL3，重復(fù)上述操作一次，合并CHCL3相。將CHCL3水浴60℃蒸干，殘?jiān)?.2moL·L-1的鹽酸和甲醇以3：7比例混合均勻的溶液定容至1mL，臨用前用0.45?m微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

HPLC色譜條件? 采用Inertsil ODS-3C18色譜柱（250×4.6mm，5?m），流動(dòng)相為甲醇-1%HAC（35：65），流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，進(jìn)樣量20?L，柱溫30 ℃。在該色譜條件下，川芎嗪色譜峰圖形較好，見(jiàn)圖1。

方法學(xué)考察

線性關(guān)系的考察? 分別精密量取川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品溶液（300?g·mL-1）0.010、0.039、0.156、0.625、2.500mL，置10mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取以上稀釋的溶液各20?L，進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y=59.18X+127.16（r=0.9998），川芎嗪在0.29300?g·mL-1有良好的線性關(guān)系。

精密度實(shí)驗(yàn)? 取同一供試品溶液，連續(xù)檢測(cè)6次，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的RSD為2.58%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)? 取同一供試品溶液，按2.3項(xiàng)下的色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)行測(cè)定，川芎嗪峰面積的RSD為2.46%，說(shuō)明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)? 取同一供試品溶液6份，按2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果川芎嗪的含量的RSD為1.86%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)? 精密吸取已知含量為9.31?g·mL-1 ，恒順鎮(zhèn)江香醋7.5mL（批號(hào)：20200415），共6份，加入川芎嗪對(duì)照品溶液適量，按2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得的回收率為98.08%，RSD為1.56%，該方法回收率高，符合含量測(cè)定的要求。

樣品測(cè)定? 取2.2項(xiàng)下供試品溶液，按2.3項(xiàng)下的HPLC色譜條件依次進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中川芎嗪的含量，見(jiàn)表2

討論

本文用HPLC法測(cè)定13批市售炮制輔料醋中川芎嗪的含量，發(fā)現(xiàn)不同方法釀制的輔料醋中川芎嗪的含量也不同。德馨齋白醋、海天白米醋采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)，均未檢測(cè)到川芎嗪，這與釀造過(guò)程中的脫色[4]有關(guān)，脫色過(guò)程中選擇活性炭作為吸附劑，活性炭對(duì)極性基團(tuán)的吸附能力較強(qiáng)，凡是分子中含有極性基團(tuán)的物質(zhì)都容易被活性炭吸附，川芎嗪可能在脫色過(guò)程被吸附除去。因此，白醋及白米醋不適合作為中藥炮制的輔料醋。批號(hào)為20110928的恒順鎮(zhèn)江香醋和批號(hào)為20200415的恒順鎮(zhèn)江香醋生產(chǎn)原料均為糯米、麥麩、大米、大曲，川芎嗪的含量相差較大，這與陳放過(guò)程中的美德拉反應(yīng)有關(guān)，隨著醋存放時(shí)間的增長(zhǎng)，川芎嗪的含量會(huì)持續(xù)增加[3]。米醋主要有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種發(fā)酵方式，而液態(tài)發(fā)酵法周期較短（大約7d），而固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)周期比較長(zhǎng)（大約30d），更利于多種微生物及酶的參與，所發(fā)酵醋的風(fēng)味口感更好[5]。因此，固態(tài)發(fā)酵的食醋更適宜作為中藥炮制的輔料。綜上，不同食醋中川芎嗪的含量不同，炮制輔料醋的發(fā)酵方法、存放時(shí)間等都可對(duì)川芎嗪的含量產(chǎn)生影響，可考慮將川芎嗪作為醋的質(zhì)量控制指標(biāo)，下一步可進(jìn)行同一品種不同批次食醋間川芎嗪含量的穩(wěn)定性試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

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基金項(xiàng)目：國(guó)家中醫(yī)藥管理局全國(guó)中醫(yī)藥創(chuàng)新骨干人才培訓(xùn)項(xiàng)目（國(guó)中醫(yī)藥人教函[2019]128號(hào)）;山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃（SRT）項(xiàng)目（2020050）

作者簡(jiǎn)介

董月梅，女，從事藥物分析工作。

*通信作者，張超

董月梅? 姜其寶? 田金鳳? 宋曉? 張超*

山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院? 山東濟(jì)南? 250355