超高效液相色譜-串聯質譜法分析動物源性食品中四環素類藥物殘留

蘇志同 謝金彤 李龍 熊飛 楊健超 彭城

文章選取豬肉、雞肉、魚肉、牛奶、豬肝等基質中的四環素殘留物作為基本檢測樣本，選擇緩沖溶液作為提取液開展超聲提取，經過C18固相萃取小柱凈化和脫溶劑的處理之后額外使用甲醇水來對物質進行溶解，溶解處理之后將這些物質放置在超高效液相色譜串聯質譜上完成檢測，檢測結果發現樣本中四環素類殘留在10ug/kg-2MRL范圍內的回收率為75%左右，RSD<10%，基本上能夠滿足農業部門頒布的公告要求。

四環素類藥物是一種廣譜抗生素，在畜牧業、水生生物產業中得到了廣泛的應用，能夠對動物進行疾病的診斷、預防和治療，從而更好地促進動物生長，提高飼料的轉化率，帶來良好的經濟效益。但是從實際應用情況來看，四環素藥物使用存在殘留的現象，人們在長期食用含有四環素藥物殘留的動物食品會危害到個人健康。為此，需要相關人員按照規范的標準仔細檢查動物源性食品中四環素類藥物殘留情況。

動物源性食品中四環素類藥物殘留檢測實驗

儀器設備和試劑

動物源性食品中四環素類藥物殘留檢測實驗所使用的儀器設備包含超高效液相色譜-質譜儀、R23型離心機、氮吹儀、均質器。試劑包含色譜純、實驗用水、緩沖液。另外，還需要按照規范的比例要求配比儲備液、工作液。即分別稱量各10mg的標準品，使用溶劑分解之后將其轉移到100ml 的棕色容量瓶中定容處理，定容處理之后將其放置在零下20攝氏度的環境下保存。

儀器使用分析條件

超高效液相色譜條件

色譜柱的型號為RP18色譜柱，規格為100mmx2.1mm，1.7um;色譜柱的溫度為30℃;樣品室內溫度為10℃;進樣體積為10ul;流動相A為甲醇;流動相B為0.1%體積比例的甲酸水溶液。

超高效液相質譜條件

超高效液相質譜電離的方式是大氣壓電噴霧，電離電壓的基本設定值為3.8KV，錐孔的電壓為30V，離子源的溫度為100℃，維孔反吹氣流量為每小時85L，脫溶劑氣的溫度為300℃，脫溶劑的氣流量為每小時400L，檢測方式為多反應監測模式。超高效液相質譜條件基本情況如表一所示。

試驗方法

提取

提取動物組織試樣10g放置在100ml 的離心管中，在其中加入20ml 的溶劑均勻的提取3分鐘，之后按照每分鐘4000轉的速度使用離心機轉動5分鐘，將上面的清液放置在不具備水硫酸鈉的漏斗中，而后轉移到雞心瓶中，殘渣使用溶劑反復提取，在一定時間之后進行最終的兩次提取，合并形成提取液，而后將提取液放置在40℃的環境下減壓快速濃縮到干燥的狀態，準備凈化。

凈化和測定

在上文等待凈化的提取液中加入比例在99.8%左右的甲酸水溶液0.8ml，按照渦旋的狀態緩和攪拌處理，將溶解液轉移到10ml的離心管中，按照每分鐘4000轉的離心機轉動速度轉動兩分鐘，對下層清液體過濾，過濾后的樣品放置到樣品瓶中，按照規范的標準來完成測試。

實驗結果和討論

優化前期處理條件

在對比乙腈和丙酮作為提取液后的提取率之后發現乙腈的提取效果良好，而出現這種現象的原因是乙腈的極性比丙酮大，對被檢測物體的溶解性也比較強，因而在實驗操作的時候會選擇乙腈來作為基本提取溶液。

在凈化優化的過程中考慮到動物組織中的油脂比較多，因而會使得儀器設備在開展污染檢測的時候被背景干擾。為了達到理想的凈化效果，需要對設備開展去油處理。同時，考慮到被檢測物的極性比較大，和乙烷不會融合，因此使用正乙烷來去除油脂，減少基質對儀器設備測量的干擾。

色譜條件的優化

磺胺和喹諾酮藥物和乙腈適合融合在一起，因此會選擇乙腈和水的混合體來作為基本流動相。考慮到磺胺藥物分子結構和喹諾酮藥物的介質含量，因此，在檢測的時候需要在流動相中加入甲酸這種物質，通過甲酸的增加來提升離子化效率。

一系列的試驗結果證明，在甲酸和水溶液處于水相狀態的時候，被檢測物質的離子效率比較高，檢測靈敏度也比較精準。因此，在試驗操作的時候選擇流動相體系來組成乙腈和甲酸水溶液。

色譜行為

在儀器工作條件下對每升1mg的混合標準溶液開展檢測，各個獸藥總離子流色譜圖如圖一所示。

圖一：各個獸藥總離子流色譜圖

（1-10分別代表磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺苯、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉。）

標準曲線和檢出限

為了能夠消除基質效應對定量測定的影響，要重新配置包含磺胺、喹諾酮的混合溶液。在儀器工作環境中對一系列的試驗進行分析，并繪制出標準的曲線，根據結果發現每一升范圍內的各個標準物質在0.01mg到0.2mg的范圍內會呈現出一種線性的關系，相關系數超過了0.996的比例，總體上會以三倍信噪比來作為基本檢測方式。

方式回收率和精密度

在10m空白動物組織試樣中分別加入0.01mg、0.05mg和0.2mg三個濃度的19種混合標準溶液作為基本回收檢驗的樣本溶液， 平行測定五次，回收率和相對標準偏差如表二所示。

樣品分析

規范的試樣方式對市場上的肉類進行分析，最終發現磺胺喹惡啉、恩諾沙星、諾氟沙星在雞肉中都有檢出，其質量分數分別為0.1/0.01/0.01mg，魚和熟肉串中檢定出了恩諾沙星，質量分數均為0.01mg，牛肉和豬肉的試羊檢測沒有出現任何獸藥。

綜上所述，文章實驗打造出了三種四環素類藥物的LC-MS/MS檢測方式，在實驗操作的過程中對加標量的樣品開展了檢測，檢測結果證明前處理方式回收率在95%到105%之間，回收率在標定的范圍內。固相萃取方式穩定，且色譜柱的重現性比較高，由此證明這種方法適合應用在動物源性食品中四環素殘留藥物的檢測工作中。

蘇志同1? ?謝金彤1? ?李? 龍2? ?熊? 飛1? ?楊健超1? ?彭? 城1

1.南京海關動植物與食品檢測中心

2.白銀市食品檢驗檢測中心