血流感染和食物中毒來源的蠟樣芽胞桿菌分子特征的比較

劉 娟 謝成彬 蘇 喆 王頻佳

1.成都醫學院檢驗醫學院，四川成都 610500；2.四川省婦幼保健院 成都醫學院附屬婦女兒童醫院檢驗科，四川成都 610045

蠟樣芽胞桿菌是一種革蘭陽性桿菌，可以產生大量能形成孔和破壞膜的毒素和酶[1-2]，與腹瀉有關的毒素主要包括溶血素BL(HBL)、非溶血性腸毒素(NHE)、細胞毒素K(cytK)、腸毒素FM(entFM)和腸毒素T(bceT)等，而與嘔吐相關的毒素則主要是致嘔吐毒素cereulide[3]，相關的基因有EM1 等[4]。該菌是食物中毒(food poisoning，FP)的常見病原菌，也是血流感染(bloodstream infection，BSI)[5-6]、肺炎[7]、中樞神經系統感染[8]等的重要致病菌。已有研究報告分析了該菌血流感染的危險因素[9-12]，但關于BSI 來源菌株的分子生物學特征卻鮮有報道。本研究分析了兒童BSI 來源菌株的分子生物學特征，并與FP 來源菌株進行比較，有助于進一步認識該菌的生物學特征，為該菌血流感染的精準治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

2015 年1 月—2019 年6 月從四川省婦幼保健院住院患兒血培養中分離到18 株蠟樣芽胞桿菌，從食物中毒患者糞便中分離到21 株(15 株來自四川省婦幼保健院，6 株由四川省疾控中心惠贈)。所有菌株經生化鑒定和質譜檢測確定為蠟樣芽胞桿菌。BSI 來源菌株的納入標準：1 d 內采集的兩瓶血培養均為陽性或者連續兩次血培養的檢測結果一致。

1.2 主要儀器和試劑

全自動微生物質譜檢測系統(鄭州安圖生物工程股份有限公司)；PCR 儀、水平電泳儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad 公司)；芽胞桿菌檢測試劑盒(105-007620-00，湖南長沙天地人生物科技有限公司)；細菌基因組DNA 提取試劑盒[DP302，天根生化科技(北京)有限公司]；PCR 試劑(TP001，北京擎科新業生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 藥敏試驗 使用芽胞桿菌檢測試劑盒，采用微量肉湯稀釋法對14 種抗菌藥物進行藥敏試驗，藥敏折點標準參照美國臨床和實驗室標準協會《不常見或苛養菌藥敏試驗(M45-A3)》[13]。

1.3.2 毒力基因檢測 各菌株用LB 肉湯復蘇后，按照試劑盒說明書提取基因組DNA。參照文獻[14]合成10 種毒力基因的引物。PCR 反應體系20 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)1 μL，2×PCR Mix 10 μL，滅菌ddH2O2補足體積。擴增條件：98℃預變性2 min，98℃10 s，60℃15 s，72℃15 s，30 個循環，72℃5 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。

1.3.3 ERIC-PCR 分型引物：F：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'，R：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'。PCR 擴增條件參照本實驗室既往條件[15]，反應體系25 μL：DNA 模板2 μL，引物(10 μmol/L)2 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O2補足體積。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。使用Quantity One 4.6.2 軟件對電泳圖進行聚類分析，選擇非加權對數算術平均法(UPMGA)，繪制遺傳關系圖。以0.8 相似度為界限，將相似系數＞0.8 的歸為同一基因型。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用雙側Fisher確切概率法。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏試驗

藥敏結果顯示，39 株蠟樣芽胞桿菌對青霉素G和氨芐西林的耐藥率達到95%以上，而對其他大部分抗菌藥物均具有較好的敏感性，見圖1。兩類來源菌株的藥敏結果基本一致，而BSI 來源菌株對復方新諾明的耐藥率為66.7%，高于FP 來源菌株的23.8%，差異有統計學意義(P=0.011)，見圖2。

圖1 39 株蠟樣芽胞桿菌藥敏試驗結果

圖2 兩種來源的蠟樣芽胞桿菌耐藥情況比較

2.2 兩種來源菌株毒力基因攜帶情況

毒力基因檢測發現，所有菌株均不攜帶HBL 基因(hbl A、hbl C 和hbl D)和NHE 基因nhe A，而NHE 基因nhe B 和nhe C 的攜帶率均為100%。嘔吐毒素基因EM1 的總攜帶率為15.4%(6/39)，陽性株均來自FP 標本；BSI 來源菌株與FP 來源菌株嘔吐毒素基因EM1攜帶率比較，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 兩種來源菌株毒力基因攜帶情況[株數(%)]

2.3 39 株蠟樣芽胞桿菌毒力基因譜

根據毒力基因的攜帶情況可將39 株蠟樣芽胞桿菌分為6 個毒力基因型。Ⅲ型毒力基因中，BSI 來源菌株與FP 來源菌株毒力基因譜比較，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 39 株蠟樣芽胞桿菌毒力基因譜

2.4 ERIC-PCR 基因分型

ERIC-PCR 分型發現，39 株蠟樣芽胞桿菌分為31 個基因型。13、23、26、28 和31 型都存在2 株以上菌株；26 和31 型菌株為不同來源，其他3 個菌株均為相同來源。對上述5 個分型的菌株進一步分析發現，除28 型的2 株具有相同耐藥譜和毒力譜外，其余同一分型內菌株的耐藥譜和/或毒力譜不同。

3 討論

蠟樣芽胞桿菌是一種常見的食源性條件致病菌[16-18]。由該菌引起的血流感染通常被認為是植入物或導管相關性感染，近年來國外也有該菌引起嚴重BSI和院內感染[19-20]的報道。本研究收集到的18 株BSI來源菌株均分離自兒科患者，可能是這些患兒免疫系統尚未發育完善，再加上長期機械通氣或靜脈置管等，容易出現如蠟樣芽胞桿菌等環境微生物導致的播散性感染[21]。

蠟樣芽胞桿菌通常對青霉素和頭孢菌素產生耐藥性，這與細菌產生的廣譜β-內酰胺酶有關[22-23]。本研究結果顯示，BSI 菌株對青霉素G 和氨芐西林幾乎均耐藥，對復方新諾明的耐藥率達到66.7%，但對其他抗菌藥物均表現出很好的敏感性。而Ikeda 等[24]對29 株BSI 來源的菌株進行了藥敏試驗，發現65.5%的菌株對克林霉素耐藥，10.3%的菌株對左氧氟沙星耐藥。這些結果的差異可能與地域等因素有關。另外，值得注意的是，BSI 來源菌株的耐藥率高于FP 來源菌株，這其中的原因值得進一步研究。

本研究結果顯示，兩種來源菌株與腹瀉相關的毒素基因攜帶情況大致相同，其中nhe 攜帶率最高，其次是ent FM，與Yu 等[25]研究結果一致；兩種來源菌株的嘔吐相關基因EM1 的攜帶情況則有所不同，EM1基因主要存在于FP 來源菌株中。39 株蠟樣芽胞桿菌根據毒力基因譜可分為6 個型別，所有菌株均至少攜帶3 種毒力基因，53.8%(21/39)的菌株具有nheBnheC-cytK-entFM 的毒力譜；BSI 來源菌株的毒力譜分布相對集中，72.2%(13/18)的菌株具有nheB-nheCcytK-entFM 的毒力基因譜；而FP 來源菌株的毒力譜分布則相對分散，21 株菌中具有第Ⅰ～Ⅳ型毒力譜的菌株分別占38.1%、19.0%、28.6%、4.8%、4.8%和4.8%。另外，具有nheB-nheC-cytK-entFM-EM1 毒力譜的6 株菌均來自于FP 標本，這種差異是特例還是共性還需進一步研究。

ERIC-PCR 分型結果顯示，兩種來源菌株的基因型表現出明顯的多樣性，大多數型別只含有1 株蠟樣芽胞桿菌，擁有2 株以上菌株的型別中菌株的來源、耐藥譜和毒力譜也不相同。對耐藥譜和毒力譜完全一致的第28 型的2 株BSI 來源菌株進行進一步追蹤，發現兩例患者住院時間相近，且均使用過靜脈插管術，可疑為院內感染菌株。Akamatsu 等[26]對從醫院感染標本中分離到的蠟樣芽胞桿菌進行多位點序列分型，發現在2006、2013 和2016 年日本3 個地點發生的醫院感染病例中，以新登記的蠟樣芽孢桿菌ST1420 序列型為主。那么在BSI 來源菌株是否存在流行序列，以及與其他來源菌株是否存在差異將是今后研究的重要問題。當地可以建立該菌毒素攜帶情況和基因分型的數據庫，為研究不同來源菌株的分子流行病學提供依據，從而有助于該菌的主動監測和溯源。