伴生菌誘導的云南松揮發性化合物對云南切梢小蠹嗅覺行為影響研究*

馮丹，王藝璇，管國偉，袁瑞玲，陳鵬

(1.云南省林業和草原科學院，云南 昆明 650201；2.西南林業大學，云南 昆明 650224)

小蠹蟲(Tomicus)危害是小蠹的蛀害及其伴生菌的協同侵染，共同打破寄主樹木對病蟲害抗御的結果[1]。小蠹蟲伴生菌(Fungi associated with bark beetle)，也叫藍污真菌(Blue stain fungi)是小蠹蟲在蛀干過程中攜帶的病原微生物。云南松(Pinusyunnanensis)受到這些病原微生物侵染后木質部會留下藍變菌斑、失水斑和松脂斑[2]；韌皮部會形成一個長橢圓形的、棕褐色、濕潤的壞死斑塊，能夠幫助小蠹蟲成功蛀害[3]。

植物受到昆蟲或病原微生物的危害后，自身會產生一些次生代謝產物以抵抗外界為害[4-5]。植物揮發性化合物是其中一類重要的次生代謝產物，其對昆蟲正常的生長發育、內分泌、神經和消化等系統有影響[6]。目前國內外普遍認為小蠹蟲的寄主選擇行為與森林生態系統中植物揮發性化合物的種類、濃度和組分等存在密切的關系[7-9]。近幾年來，研究人員主要關注伴生菌與寄主植物的相互關系，一些研究也初步證明了小蠹蟲伴生菌能改變寄主的揮發性化合物的種類和含量。潘悅等[10]接種一種小蠹蟲伴生菌(Ophiostomacanum)后分3個采樣時間觀察云南松萜烯類化合物的變化情況，結果表明接種30 d后云南松韌皮部中α-蒎烯、莰烯和β-月桂烯的絕對含量顯著高于對照，然而，接種時間的長短對云南松單萜化合物的影響不明顯。Pan Yue等[11]接種3種小蠹蟲伴生菌(Leptographiumwushanense,L.sinense和Ophiostomacanum)發現，伴生菌均能誘導寄主的6種單萜類化合物濃度增加，但只有接種L.wushanense10 d和20 d后能顯著提高云南松中α-蒎烯、莰烯、β-月桂烯、β-水芹烯和α-松油烯的濃度。

多臂嗅覺儀是一個8通道的實驗裝置(圖1)，本項目組改進了以往“Y”形嗅覺儀一次只能提供兩種氣味源供昆蟲選擇的缺陷，可以一次研究多種氣味源對小蠹蟲的影響，不僅排出野外其他人為干擾因素的同時還可以在室內模擬野外復雜氣味環境進行昆蟲寄主選擇試驗。為了明確伴生菌誘導云南松揮發性成分種類或組分的改變對小蠹蟲寄主選擇是否有影響，本研究運用多臂嗅覺儀提供多種伴生菌誘導云南松改變的氣味源對云南松小蠹嗅覺行為進行研究。在過去總是聚焦伴生菌與寄主植物相互關系的基礎上引入小蠹蟲。小蠹蟲既是攜帶和傳播伴生菌的宿主，也是造成云南松死亡的主要害蟲之一，是研究云南松與伴生菌相互關系中的另一個重要環節。因此，本研究從伴生菌-云南松-小蠹蟲入手，全面研究5種伴生菌對云南松揮發性化合物的影響，以及伴生菌誘導的云南松揮發性化合物對云南松小蠹嗅覺行為的影響，分析云南松、伴生菌、小蠹蟲三者間的相互關系，探索云南切梢小蠹(T.yunnanensis)的化學生態學防治方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

5個供試菌株YSL40317(O.canum)、SNE40724(O.ips)、YML50409(O.abietinum)、HLH40315(L.conjunctum)、HPA40513(L.yunnanensis)由云南省林業和草原科學院森林保護研究所提供。

1.1.2 供試成蟲

本試驗供試昆蟲采自云南省陸良縣云南松純林，野外采集的云南松木段通過室內飼養后獲得供試成蟲。嗅覺試驗完成后，回收所有供試成蟲在體視鏡下鑒定，結果均為云南切梢小蠹。

1.1.3 供試植物

試驗林分設在云南省林業和草原科學院的昆明樹木園內(102.74°E、25.15°N,海拔1 955.80 m)。選擇一塊坡度20°，坡向西南向，郁閉度80%的云南松林樣地，在該樣地中選擇胸徑18～20 cm，樹齡20 a的健康的云南松18株。

1.2 儀器設備

Carboxen-PDMS萃取頭(黑色，Supelco，美國)；7890A/5975氣質聯用儀(Agilent，美國)；多臂嗅覺儀(實用新型專利)。

1.3 揮發性成分測定

采用HS-SPME-GC-MS聯用儀(AGILENT，美國)測定小蠹蟲伴生菌誘導的云南松揮發性成分。樣品制備：取接種了伴生菌的云南松韌皮部組織(CK為未接種伴生菌的云南松韌皮部組織)1.0 g于20 mL頂空瓶中。將頂空瓶放置于80 ℃水浴中，用固相微萃取頭置于頂空瓶中進行萃取，萃取時間為30 min。之后將固相微萃取頭插入氣相色譜進樣口進樣，時間為2 min，經氣相色譜分離后用質譜鑒定。

色譜條件 HP-5MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 um)，載氣為氦氣(純度為99.999%)，流速為1.0 mL/min，分流比為20︰1。升溫程序為初始溫度50 ℃，保持2 min；以5 ℃/min的速率升溫至140 ℃；保持1 min。進樣口溫度為280 ℃，進樣量為2.0 μL，溶劑延遲1 min。

質譜條件 電轟擊電離(EI)源，電離能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃；掃描范圍為29～350 amu，質譜檢索圖庫為Nist 11標準譜庫。

1.4 選擇行為測定

選擇行為測試裝置為自制的實用新型專利多臂嗅覺儀(ZL201721699322.5)，多臂嗅覺儀采用無色透明的玻璃制作，內徑為2 cm，各氣味源通道和接蟲通道長20 cm,氣味源通道以20°的夾角等角分布。氣泵通過空氣過濾裝置(活性炭和蒸餾水)后連接多臂嗅覺儀，各裝置間用醫用硅膠管連接(圖1)。將不同的化合物用無水乙醇稀釋成濃度1 mg/mL備用，分別在2 cm×4 cm的滅菌濾紙上加入200 uL化合物，對照為等計量的無水乙醇，然后將濾紙放到多臂嗅覺儀的各個氣味瓶中，進氣流量控制在250 mL/min，室內溫度控制在25 ℃左右，測試期間用黑布遮光。采集饑餓成蟲300頭備用。每次將30頭成蟲放入多臂嗅覺儀的接蟲室后計時，10 min后記錄各氣味瓶中小蠹蟲的數量。重復10次，每次測試后順時針更換各氣味瓶的位置，并更換濾紙。試驗結束后用95%乙醇沖洗整個裝置待用。

圖1 昆蟲嗅覺行為選擇的裝置示意Fig.1 olfactory behavior installation

1.5 云南切梢小蠹對氣味組合的行為反應

運用對云南切梢小蠹有較強引誘力的4種化合物(α-蒎烯、金合歡烯、4-烯丙基苯甲醚和長葉烯)，設置3種濃度梯度(0.5、1.0、2 mg/mL)進行不同氣味組合對云南切梢小蠹引誘力的測定。

1.6 數據分析

數據采用SPSS軟件處理。云南切梢小蠹對揮發物的嗅覺選擇采用Dunnett-t法進行顯著性檢驗。氣味源組合的正交表由SPSS軟件生成，云南切梢小蠹對氣味源組合的選擇的數據用Dunnett T3法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 伴生菌誘導的云南松揮發性成分

云南松接種小蠹蟲伴生菌后改變了云南松韌皮部中揮發性成分的相對含量和組成(表1)。與對照相比，接種5種不同的小蠹蟲伴生菌后，云南松韌皮部中α-蒎烯、β-蒎烯、4烯丙基苯甲醚、金合歡烯和β-月桂烯的相對含量發生了改變，其中α-蒎烯和β-月桂烯的相對含量增高，β-蒎烯、4烯丙基苯甲醚、金合歡烯的相對含量減少。云南松接種O.canum后韌皮部能產生3-蒈稀(40.03%±0.69%)和β-石竹稀(2.92%±0.05%)。L.conjunctum、O.ips和O.abietinum能誘導云南松韌皮部產生莰烯分別為(1.36%±0.19%、1.62%±0.11%、1.47%±0.05%)。除接種L.conjunctum以外，其他4種小蠹蟲伴生菌均誘導云南松不產生長葉烯。

表1 5種伴生菌誘導云南松韌皮部產生的揮發性物質成分及其含量Tab.1 Effects of 5 blue stain fungi on Pinus yunnanensis %

2.2 云南切梢小蠹對揮發物的嗅覺選擇

云南切梢小蠹對揮發物的嗅覺選擇結果見圖2。8種化合物與對照相比，4-烯丙基苯甲醚、金合歡烯、α-蒎烯和長葉烯對云南切梢小蠹的引誘力最強(P<0.01)，云南切梢小蠹的選擇率分別是19.5%、19%、17%和17%。3-蒈烯、莰烯和β-月桂烯對云南切梢小蠹的引誘能力與對照相比沒有顯著差異。云南切梢小蠹對β-蒎烯的沒有選擇性(0%)。

圖2 云南松次生代謝對小蠹蟲行為的影響注：選擇率為平均選擇率±標準誤(mean±SE)； *表示P<0.05；**表示P<0.01。Fig.2 Effects of metabolism of P.yunnanensison bark beetles

2.3 云南切梢小蠹對氣味源組合的選擇

試驗結果見圖3，與其他氣味源組合相比較，氣味源組合2123和3132對云南切梢小蠹的引誘能力最強(P<0.01)，分別為23.67%和24%；其次是氣味源組合3213(P<0.01)，云南切梢小蠹的選擇率為13.67%；氣味源組合1222、1333和2312對云南切梢小蠹有一定的引誘能力，云南切梢小蠹選擇氣味源組合1222的比率為10%，選擇氣源味組合1333的比率為10.67%，選擇氣味源組合2312的比率為8.33%，均高于不做選擇的小蠹蟲的比率2%。

圖3 4種化合物氣味源組合對小蠹蟲的影響Fig.3 Effects of 4 odor combinations on bark beetles

3 討論與結論

切梢小蠹伴生菌侵染致病機理是一個較為復雜的過程，本研究運用固相微萃取和GC-MS聯用技術測定小蠹蟲伴生菌對云南松韌皮部揮發性次生代謝產物的影響。結果表明，不同的小蠹蟲伴生菌均能誘導云南松韌皮部的α-蒎烯和β-月桂烯的相對含量增高，β-蒎烯、4烯丙基苯甲醚、金合歡烯的相對含量減少，此外，不同的小蠹蟲伴生菌還能誘導云南松韌皮部的揮發性成分產生特殊的改變，如O.canum能誘導云南松產生3-蒈烯、β-石竹烯和莰烯等。本研究運用上述試驗結果的物質作為氣味源，研究云南切梢小蠹對這些氣味源的嗅覺行為反應。云南切梢小蠹對8種化合物有不同程度的響應，4-烯丙基苯甲醚、金合歡烯、α-蒎烯和長葉烯對云南切梢小蠹具有較強的引誘能力，3-蒈烯、莰烯和β-月桂烯對云南切梢小蠹的引誘能力較弱，云南切梢小蠹對β-蒎烯的選擇率為0%。以不同濃度的4-烯丙基苯甲醚、金合歡烯、α-蒎烯和長葉烯作為氣味源組合，設計正交試驗檢測云南切梢小蠹對以上4種化合物組合的嗅覺選擇,結果顯示：α-蒎烯2 mg/mL、金合歡烯1 mg/mL、4-烯丙基苯甲醚0.5 mg/mL和長葉烯2 mg/mL對云南切梢小蠹有較好的引誘作用。

小蠹-真菌共生關系的經典理論認為小蠹蟲伴生菌是導致寄主樹木死亡的關鍵[12]。一些研究認為昆蟲尋找適宜的棲息地的信息信號來源于微生物，O.novoulmi釋放的揮發物對榆樹小蠹(Hyrurgopinusrufipes)有吸引力[13]；Xyleborusglabratus能被其共生菌的揮發性成分吸引[14]；ZhaoTao[15]發現小蠹蟲伴生菌通過自身合成雙環縮酮類(bicyclic ketals)信息素幫助云杉小蠹(Ipstypographus)成功地在健康寄主上定植，證實了小蠹-真菌趨同進化的復合系統。本研究從小蠹、真菌、寄主三者相互關系的角度出發，通過接種小蠹蟲伴生菌后檢測寄主的揮發性成分，發現5種伴生菌均能改變寄主的揮發性成分，這些揮發性物質可能影響云南切梢小蠹對寄主選擇。

云南切梢小蠹對寄主云南松的侵害分為兩個階段，在蛀梢期攻擊云南松的枝梢進行補充營養，待性成熟后進入交尾產卵期則攻擊云南松的樹干[16]。已有研究表明：在蛀梢期，云南切梢小蠹對云南松枝梢揮發物表現出較強的趨向反應，而對云南松樹干的揮發物則表現出一定的驅避反應，說明蛀梢期切梢小蠹屬昆蟲不僅對不同松屬樹種具有不同的選擇性，不同性成熟程度的切梢小蠹也對同一寄主不同部位的揮發物組合具有不同的嗅覺和行為反應[17-19]。本試驗在2020年6月開展，屬于云南切梢小蠹的新成蟲的蛀梢期，研究結果提示：α-蒎烯、4-烯丙基苯甲醚、金合歡烯和長葉烯對蛀梢期的云南切梢小蠹有較強的引誘力， 3-蒈烯、β-月桂烯的引誘力不強，β-蒎烯甚至對這個時期的云南切梢小蠹有一定的驅避作用。

不同的小蠹蟲攜帶伴生菌的方式和比率不同，有的小蠹蟲有專門的貯菌器可以攜帶真菌的孢子和菌絲，有的小蠹蟲則通過小蠹蟲體表攜帶伴生菌[20-22]；有的小蠹攜帶一種真菌；有的小蠹攜帶幾種真菌。而不同的伴生菌誘導寄主揮發性化合物組成和含量產生差異，從而影響小蠹蟲的嗅覺和行為選擇。本研究利用多臂嗅覺儀初步證實了一定比例的寄主揮發性氣味組成對云南切梢小蠹有較好的引誘力。但是，云南切梢小蠹帶菌比率與蠹害程度間存在一定的隨機性[23]，因此誘導云南松揮發性化合物的變化也是相對較復雜和隨機的。

綜上所述，伴生菌依靠小蠹蟲傳播，而小蠹蟲則通過伴生菌提高攻擊寄主的效果，并受到環境的影響，小蠹-真菌-寄主可能經過長時間的進化形成一個動態的可變的結構關系，今后研究伴生菌-云南松的關系對小蠹蟲行為的影響，可以為小蠹蟲防治開發系列引誘劑提供科學依據。