肺炎鏈球菌核酸檢測試劑國家參考品的研制及驗證

李 康 黃 洋 王春娥 李江姣 梁 麗 陳 馳 劉茹鳳 葉 強

中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所細菌多糖和結合疫苗室，北京 102629

肺炎鏈球菌是引起兒童肺炎鏈球菌性疾病的主要病原菌[1]。肺炎鏈球菌也是新型冠狀病毒肺炎感染病例合并感染的主要呼吸道病原菌[2-4]。根據莢膜多糖抗原的不同，肺炎鏈球菌可以分為90 多種血清型[5]。早期及時準確的診斷有助于肺炎鏈球菌性疾病的臨床治療。近年來，熒光定量PCR 方法[6-7]、生物芯片法[8]、PCR 毛細電泳片段分析法[9-10]、數字PCR 法[11]和測序法[12]等核酸檢測技術迅速發展，促進了肺炎鏈球菌核酸檢測試劑的研發。不同的試劑檢測時取用的樣本量及檢測的目的基因不同，其檢測結果的一致性及靈敏度存在差異。目前，國內尚無統一的肺炎鏈球菌國家參考品用于此類核酸檢測試劑的質量控制和評價。因此，本研究擬研制肺炎鏈球菌核酸檢測試劑國家參考品，以期用于肺炎鏈球菌核酸檢測試劑的質量控制與評價。

1 材料與方法

1.1 菌種

參考品制備用菌株均來源于中國醫學細菌保藏管理中心（CMCC）。見表1。

表1 參考品菌株信息

1.2 主要試劑及儀器

哥倫比亞血瓊脂（貨號：279240）、Todd Hewitt Broth（貨號：249240）和Yeast extract（貨號：212750）均購自BD 公司；中國細菌濁度標準國家標準品（批號：230021-201960）由中國食品藥品檢定研究院提供；肺炎鏈球菌核酸檢測試劑盒A（批號：20200201）、B（批號：2020 0325）、C（批號：20200602）和D（批號：P20191201）分別購自4 家肺炎鏈球菌核酸檢測試劑生產企業。NU-5810E 型二氧化碳培養箱購自NUAIRE 公司；ABI7500型熒光定量擴增儀購自ABI 公司。

1.3 菌懸液的制備

將參考品菌株分別接種于適宜生長的培養基上，于最適溫度下進行培養。取固體培養物或經離心收集的液體培養物沉淀，用滅菌生理鹽水重懸后制備成菌懸液。采用比濁法[13-14]或平皿計數法[15]測定菌懸液的濃度。菌懸液經熱滅活處理后，稀釋至適當濃度，用于參考品的制備。

1.4 參考品的制備

將10 株陽性參考品肺炎鏈球菌菌懸液稀釋至1.0×107個/mL 制備陽性參考品（P1～P10）各150 支，0.5 mL/支。將腦膜炎奈瑟菌29052 菌懸液稀釋至1.0×106個/mL，其余9 株陰性參考品菌懸液稀釋至1.0×107個/mL 制備陰性參考品（N1～N10）各150 支，0.5 mL/支。將肺炎鏈球菌31001 菌懸液稀釋至1.0×107個/mL 制備重復性參考品（R）450 支和最低檢出限參考品（S）150 支，0.8 mL/支。1 套肺炎鏈球菌國家參考品由陽性參考品（P1～P10）各1 支、陰性參考品（N1～N10）各1 支、3 支重復性參考品和1 支最低檢出限參考品組成，-20℃及以下保存。

1.5 參考品的分裝均勻性評估

隨機抽取陽性參考品（P1～P10）和最低檢出限參考品各10 支，重復性參考品15 支，用試劑盒C 進行檢測，重復2 次。計算循環閾值（Ct 值）的均值、標準差（SD）及變異系數（CV）。

1.6 參考品的穩定性評估

將陽性參考品（P1～P10）、最低檢出限參考品各9 支分別于2～8℃、室溫（25℃）、37℃放置3、7 d，反復凍融3 次、5 次，以-20℃保存的參考品作為對照，用試劑盒B 進行檢測，重復2 次。考察參考品于不同溫度下放置不同時間及反復凍融的穩定性。

1.7 參考品的驗證

分別用4 種肺炎鏈球菌核酸檢測試劑盒對參考品進行驗證。準確性驗證：檢測陽性參考品（P1～P10）各1 支，應全部為肺炎鏈球菌陽性。特異性驗證：檢測陰性參考品（N1～N10）各1 支，應全部為肺炎鏈球菌陰性。重復性驗證：合并3 支重復性參考品后進行檢測，重復檢測10 次，應全部為肺炎鏈球菌陽性，且Ct值的CV 應≤5.00%。最低檢出限驗證：檢測最低檢出限參考品1 支，用滅菌生理鹽水10 倍系列稀釋，取1.0×105、1.0×104、1.0×103和1.0×102個/mL 共4 個稀釋度，驗證試劑盒的最低檢出限。

2 結果

2.1 參考品的分裝均勻性評估

試驗結果顯示，陽性參考品（P1～P10）、最低檢出限參考品及重復性參考品Ct 值的CV 均在5.00%以內，說明參考品的分裝均勻度良好。見表2。

表2 參考品的分裝均勻度評估

2.2 參考品的穩定性評估

使用Kruskal-Wallis 非參數檢驗對參考品穩定性數據進行分析。結果顯示，參考品經反復凍融3、5 次處理后的Ct 值與-20℃保存的對照參考品的Ct 值比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），表明本參考品反復凍融3～5 次不影響其穩定性。將參考品分別于2～8℃、室溫（25℃）和37℃放置3、7 d 后的Ct 值與-20℃保存的對照參考品的Ct 值比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），說明本參考品在2～8℃、室溫（25℃）和37℃放置3、7 d 不影響參考品的穩定性，可以滿足運輸、使用等的穩定性要求，見表3。

表3 不同處理條件下參考品Ct 值的變化

2.3 參考品的驗證

結果顯示，4 家企業的試劑盒的準確性、特異性及重復性檢測結果均符合要求。陽性參考品的符合率均為10/10，陰性參考品的符合率均為10/10，重復性參考品的Ct 值的CV 均≤5.00%。1 家企業的試劑盒的最低檢出限為1.0×104個/mL，其他3 家企業的試劑盒的最低檢出限為1.0×103個/mL。見表4。

表4 不同企業試劑盒的驗證結果

3 討論

本研究從CMCC 選擇了20 株菌株作為參考品制備用菌株，其中陽性參考品菌株的選擇考慮了19A、19F、14、3 和23F 等流行血清型或血清群[16-18]及有趨勢上升的血清型15A 和35B[19-20]。陰性參考品菌株的選擇充分考慮了與肺炎鏈球菌感染部位相同或感染癥狀相似且常見的其他病原體，以及同屬不同種的干擾菌株，包括A 族鏈球菌[21]、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌[22]、腦膜炎奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鏈球菌（b 群）、鏈球菌（c 群）、卡他布朗漢姆菌和白喉棒狀桿菌。

根據標準物質的研制要求[23-24]，本研究對參考品的均勻性和穩定性進行了評估。參考品的分裝均勻性滿足要求。穩定性評估結果顯示參考品經反復凍融3、5 次及2～8℃、室溫（25℃）、37℃放置3、7 d，不影響其穩定性。為了保證參考品的長期供應需求，還需要持續收集參考品長期穩定性數據，以評價其長期儲存的穩定程度[25-26]。

使用4 家企業生產的試劑盒對肺炎鏈球菌國家參考品進行適用性驗證，其準確性、特異性和重復性檢測結果均符合要求，但最低檢出限存在差異。驗證結果表明，本參考品可以用于不同企業生產的試劑盒的關鍵指標的有效評價[27]。由于不同的試劑盒的檢測原理不同，今后還需要用不同原理研發的核酸檢測試劑盒進行驗證。

綜上所述，本研究研制完成一套肺炎鏈球菌核酸檢測試劑國家參考品，能夠用于肺炎鏈球菌核酸檢測試劑盒的質量控制和評價。