高通量測(cè)序技術(shù)在慢性腎病患者剛地弓形蟲感染診斷中的價(jià)值

周毓菁，徐晶晶，徐 杰，劉冬梅，何 軍

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢測(cè)中心，江蘇 蘇州 215000）

弓形蟲病是由弓形蟲感染引起的一種人畜共患寄生蟲病，貓科動(dòng)物為其終宿主和重要的傳染源，中間宿主包括多種哺乳類動(dòng)物、禽類和人類等。人類會(huì)因接觸患弓形蟲病動(dòng)物的糞便或誤食含有弓形蟲卵囊的生肉而感染弓形蟲病[1]。全球弓形蟲感染率約為30%[2]，我國(guó)弓形蟲感染率為7.9%[3]。弓形蟲主要寄生在有核細(xì)胞內(nèi)，在人體內(nèi)多為隱性感染。目前應(yīng)用較為廣泛的弓形蟲檢測(cè)方法為血清學(xué)檢測(cè)，如采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等方法檢測(cè)抗體或循環(huán)抗原[4-5]，但血清學(xué)檢測(cè)方法的敏感性不足，易造成漏診，且無法直接進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。本研究擬探討高通量測(cè)序[又稱下一代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）]技術(shù)在慢性腎臟病5期行腹膜透析患者剛地弓形蟲感染診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 病例資料

患者，女，53歲，因“反復(fù)腹痛5年余，發(fā)現(xiàn)腹膜透析液渾濁4 d”于2018年8月17日入住蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科。患者于5年前出現(xiàn)腹痛伴尿液減少，實(shí)驗(yàn)室檢查示：血肌酐310 μmol/L，尿蛋白陽性；B超檢查示：雙腎萎縮。診斷為腎功能不全。予以護(hù)腎治療后，血肌酐仍逐步升高，最高為706.7 μmol/L，于2018年7月9日起在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院行規(guī)律腹膜透析治療。2018年8月14日行腹膜透析液常規(guī)檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)透明度微混，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為146×106/L，囑患者住院治療。

患者既往有高血壓病史10余年，口服硝苯地平控釋片和鹽酸阿羅洛爾片進(jìn)行降壓治療，無糖尿病、冠心病等慢性病史。查體：雙肺呼吸音清，未聞及明顯干、濕性啰音，腹膨隆，肝脾肋下未及，無明顯壓痛、反跳痛，移動(dòng)性濁音（+），腸鳴音4～5次/min，雙腎區(qū)無明顯叩痛，余體征無明顯異常。臨床診斷為慢性腎臟病合伴腹痛，原因待查。

1.2 樣本來源及類型

2018年9月—2019年7月，臨床分別送檢該患者17份腹膜透析液和腹水樣本，其中包括進(jìn)行NGS檢測(cè)的2份腹水樣本和4份腹膜透析液樣本。同時(shí)送檢外周血樣本用于血細(xì)胞分析和弓形蟲抗體等檢測(cè)。本例患者簽署知情同意書，同意樣本僅用于臨床研究。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

1.3.1 腹水及腹膜透析液常規(guī)檢查 采用XN-10（B4）血液分析儀（日本SYSMEX公司）的體液模式及配套試劑進(jìn)行腹水和腹膜透析液細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類檢測(cè)，所有操作嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行。另取腹膜透析液5 mL，440×g離心10 min，棄上清，取沉渣直接鏡檢、碘液染色鏡檢（取沉渣1滴，加碘液1滴，顯微鏡下直接觀察）、瑞氏染色鏡檢（取沉渣1滴，涂成薄片，干燥后行瑞氏染色鏡檢）[6]。

1.3.2 腹水及腹膜透析液微生物培養(yǎng) 對(duì)腹水及腹膜透析液樣本進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和真菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基分別為哥倫比亞血平板（鄭州安圖公司）和沙保弱平板[貝瑞特生物技術(shù)（鄭州）有限責(zé)任公司]，分別置于35 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周。

1.3.3 血清弓形蟲抗體檢查 采用LIAISON XL全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（意大利索靈公司）及配套試劑檢測(cè)血清弓形蟲 IgG和IgM抗體，嚴(yán)格按儀器和試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 NGS測(cè)定及數(shù)據(jù)分析 NGS檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析均在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院與南京世和基因生物技術(shù)股份有限公司NGS聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。取2份腹水和4份腹膜透析液樣本各5 mL。2份腹水樣本沉淀后，采用大體積核酸提取試劑盒（磁珠法）[天根生化科技（北京）有限公司]從上清液中提取游離DNA，從細(xì)胞混懸液中提取混懸DNA；提取4份腹膜透析液樣本中的混懸DNA。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）檢測(cè)DNA濃度和純度。對(duì)DNA進(jìn)行隨機(jī)片段化、文庫構(gòu)建（末端修復(fù)、連接接頭、擴(kuò)增純化）、文庫質(zhì)控、定量pooling后，采用NextSeq 550Dx基因測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）測(cè)序。從NCBI參考基因組數(shù)據(jù)庫RefSeq和GenBank數(shù)據(jù)庫下載病原微生物基因組序列，該數(shù)據(jù)庫包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲。從UCSC數(shù)據(jù)庫下載人GRCh37參考基因組序列，作為宿主參考序列。對(duì)人類基因組的序列進(jìn)行去宿主處理，將非宿主序列與已知序列的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

1.4 臨床治療

患者入院后，考慮腹膜透析性腹膜炎，予以萬古霉素1.0 g留腹治療4次。腹膜透析液中發(fā)現(xiàn)疑似弓形蟲滋養(yǎng)體后，給予奧硝唑0.5 g，q 12 h×10 d治療。

2 結(jié)果

2.1 腹水及腹膜透析液常規(guī)檢查

2018年8月31日送檢的腹膜透析液樣本為無色微混，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為205×106/L，嗜酸性粒細(xì)胞百分比為50%。李凡他試驗(yàn)陰性。顯微鏡鏡檢找到異常病原體。沉渣直接鏡檢可見一些呈圓形或類圓形、體積為白細(xì)胞幾倍大的假包囊，囊內(nèi)含較多活動(dòng)滋養(yǎng)體（又稱速殖子）。碘液染色鏡檢可見棕黃色圓形或類圓形的假包囊，內(nèi)含1～4個(gè)圓形不著色結(jié)構(gòu)。瑞氏染色鏡檢可見假包囊結(jié)構(gòu)呈紫紅色，形態(tài)多樣，呈圓形、橢圓形、毛刺狀、不規(guī)則形等，內(nèi)含數(shù)個(gè)紅色細(xì)胞核和偏于一側(cè)的半月形滋養(yǎng)體。見圖1。

圖1 腹膜透析液顯微鏡鏡檢（×400）

根據(jù)病原體形態(tài)特點(diǎn)判斷為疑似阿米巴滋養(yǎng)體、弓形蟲滋養(yǎng)體，不排除其他類型原蟲感染。

2.2 腹水及腹膜透析液微生物培養(yǎng)

2份腹水和4份腹膜透析液樣本常規(guī)細(xì)菌和真菌培養(yǎng)結(jié)果均為無菌生長(zhǎng)。

2.3 血清弓形蟲抗體檢查

本例患者分別于2018年12月29日和2019年7月25日進(jìn)行2次血清弓形蟲IgM和IgG抗體檢測(cè)，結(jié)果均＜3.00 AU/mL（參考區(qū)間＜8 AU/mL），判定為陰性。

2.4 NGS檢測(cè)結(jié)果

不同時(shí)間送檢的腹水和腹膜透析液樣本不同類型DNA測(cè)序結(jié)果和分析見表1。將測(cè)序得到的有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì)，確認(rèn)檢出的有效序列均為特異性剛地弓形蟲序列。

表1 不同送檢時(shí)間送檢的腹水和腹膜透析液樣本NGS測(cè)序結(jié)果

2.5 出院后復(fù)查

患者出院2個(gè)月后復(fù)查結(jié)果顯示，腹膜透析液清晰，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為9×106/L，嗜酸性粒細(xì)胞比例接近0，鏡檢未見假包囊結(jié)構(gòu)，NGS結(jié)果未見病原體。

3 討論

剛地弓形蟲是一種常見的專性細(xì)胞內(nèi)機(jī)會(huì)致病性原蟲，屬于孢子蟲綱、真球蟲目、弓形蟲科。弓形蟲在免疫功能正常的機(jī)體中多為隱性感染，缺乏特異性的臨床癥狀和體征。弓形蟲感染的病原學(xué)檢測(cè)主要有直接鏡檢、抗體檢測(cè)等，但往往存在假陰性，無法確診[7]。本例患者腹水及腹膜透析液中有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為（100～200）×106/L，嗜酸性粒細(xì)胞百分比高達(dá)50%，鏡檢可看到疑似弓形蟲滋養(yǎng)體，提示可能寄生蟲感染，而弓形蟲抗體檢測(cè)為陰性，故需要有一種更準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來明確診斷。

NGS技術(shù)具有通量高、周期短和準(zhǔn)確性、特異性、敏感性高等優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)納入的病原體數(shù)據(jù)庫包括3 000余種細(xì)菌、4 000余種病毒、200余種真菌和140種寄生蟲，為臨床病原微生物，尤其是罕見病原微生物感染的診斷提供了更有效的方法[8]。本研究采用NGS技術(shù)直接從患者腹水及腹膜透析液樣本中檢測(cè)到病原微生物的基因序列，通過生物信息學(xué)分析，明確為剛地弓形蟲基因組，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原微生物的準(zhǔn)確診斷。但本研究結(jié)果也顯示，不同樣本來源、不同的DNA類型（游離DNA和混懸DNA）對(duì)檢測(cè)結(jié)果有明顯影響。因此，樣本采集、核酸提取的質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)庫的不斷升級(jí)是NGS技術(shù)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵。只有降低NGS檢測(cè)的假陰性率，才能提高其對(duì)危重、疑難病例的診斷能力。

WILSON等[9]在2014年采用NGS技術(shù)在1例嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷患者的腦脊液中檢出鉤端螺旋體，指導(dǎo)臨床進(jìn)行有效的靶向藥物治療，為NGS技術(shù)在診斷病原微生物感染中的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本例患者入院后，臨床根據(jù)經(jīng)驗(yàn)給予萬古霉素1.0 g，分別于2018年8月17日、8月20日、8月23日、8月27日留腹治療，并維持萬古霉素腹膜透析液濃度穩(wěn)定。在治療過程中多次行腹膜透析液常規(guī)檢測(cè)，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)始終維持在（100～213）×106/L，嗜酸性粒細(xì)胞百分比為47%～58%，提示萬古霉素抗感染治療效果欠佳。采用NGS技術(shù)檢測(cè)腹水和腹膜透析液樣本，結(jié)合顯微鏡鏡檢結(jié)果，建議臨床使用奧硝唑0.5 g，每12 h靜脈給藥治療。10 d后，腹膜透析液有核細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞百分比逐漸下降，至出院時(shí)分別降至8×106/L和8%。顯微鏡鏡檢示假包囊結(jié)構(gòu)從原來的每個(gè)視野均可見，到幾百個(gè)視野偶見1個(gè)，直至找不到，提示治療有效。出院2個(gè)月后復(fù)查，腹膜透析液清晰，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)為9×106/L，嗜酸性粒細(xì)胞百分比接近0，鏡檢未見假包囊結(jié)構(gòu)，NGS檢測(cè)未見病原體。證明了NGS為疑難疾病的診斷及治療提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。

NGS技術(shù)原則上可對(duì)樣本中任何微生物的遺傳物質(zhì)進(jìn)行鑒定，克服了常規(guī)診斷方法如鏡檢或微生物培養(yǎng)繁瑣、耗時(shí)、敏感性和特異性較低的局限性。尤其是對(duì)于長(zhǎng)期發(fā)熱和/或伴有其他臨床癥狀的不明原因感染或疼痛、人畜共患感染性疾病、罕見或特殊病原體感染、傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)反復(fù)陰性且治療效果不佳等情況，NGS技術(shù)體現(xiàn)出了前所未有的優(yōu)勢(shì)，可高效、快速、準(zhǔn)確地診斷病原體[10-11]。因此，NGS技術(shù)在臨床病原微生物感染診斷方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)和較大的應(yīng)用前景。