呼倫貝爾地區MRSA耐藥譜及分子流行病學特征分析

孫 剛，孫 輝，杜彥丹，李寅雁，李英智，董占柱，佟力軍，彭 博

（1.內蒙古林業總醫院 內蒙古民族大學第二臨床醫學院檢驗科，內蒙古 牙克石 022150；2.內蒙古民族大學附屬醫院檢驗科，內蒙古 通遼 028000 ）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcus aureus，MRSA）是引起醫院和社區獲得性感染的主要病原菌，可以引起各種致死性感染，如心內膜炎、敗血癥和肺炎等。本研究對呼倫貝爾地區MRSA的耐藥譜及分子流行病學特征進行分析，以期為臨床防控和治療金黃色葡萄球菌感染提供幫助。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2012年1月—2017年6月內蒙古呼倫貝爾地區5家醫院（內蒙古林業總醫院、牙克石市人民醫院、呼倫貝爾市人民醫院、滿洲里市人民醫院、扎蘭屯市人民醫院）MRSA非重復臨床分離株55株，其中分離自痰樣本28株、分離自咽拭子樣本和膿液樣本各8株、分離自傷口分泌物樣本7株、分離自中段尿樣本4株。質控菌株腐生葡萄球菌（BAA-750）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）購自我國國家衛生健康委臨床檢驗中心，葡萄球菌染色體mec基因盒（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）基因分型標準陽性對照菌株NCTC 10042（SCCmecⅠ型）、N315（SCCmecⅡ型）、85/2080（SCCmecⅢ型）、JCSC4744（SCCmecⅣ型）、HS663（SCCmecⅤ型）由內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科惠贈。

1.2 主要儀器與試劑

Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏系統及配套革蘭陽性菌鑒定卡GP、革蘭陽性菌藥敏卡GP-67（法國生物梅里埃公司），Veriti型PCR儀（美國ABI公司），EPS600型瓊脂糖凝膠電泳儀、4200 SF型凝膠成像系統（上海天能公司）。頭孢西丁藥敏紙片（英國Oxoid公司），金黃色葡萄球菌乳膠凝集試劑（廣東環凱微生物科技公司），溶葡萄球菌素、引物、DNA ladder Marker、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑（北京梓熙生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定和MRSA篩查 所有金黃色葡萄球菌臨床分離株均采用乳膠凝集試劑和Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏系統進行復核，并采用頭孢西丁紙片擴散法篩查MRSA。采用PCR檢測所有金黃色葡萄球菌的mecA基因與femB基因，若mecA與femB基因皆為陽性，則判斷為MRSA[1]。

1.3.2 體外藥物敏感性試驗 采用Vitek 2 Compact自動化鑒定藥敏系統分析金黃色葡萄球菌對12種抗菌藥物（紅霉素、克林霉素、四環素、復方磺胺甲噁唑、環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、慶大霉素、利福平、利奈唑胺、萬古霉素、替加環素）的耐藥性，根據美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2017年版標準判讀結果。

1.3.3 總DNA提取 采用細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取菌株DNA，-20 ℃保存備用。

1.3.4 SCCmec基因分型檢測 采用多重PCR進行SCCmec基因分型，參照文獻[2]設計引物、擴增條件、反應條件。與標準菌株出現相同產物長度的條帶為該SCCmec型別，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及V型分別出現695、937、1791、1 287及518 bp。

1.3.5 多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 采用PCR擴增金黃色葡萄球菌染色體DNA上7個管家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi及yqiL）的可變區片段，根據文獻[3]設計引物、 擴增條件、反應條件，PCR產物送北京梓熙生物科技有限公司進行純化和測序，測序采用雙向測通方法。

1.4 統計學方法

采用Whonet 5.6 軟件進行細菌耐藥性分析。MLST結果用 eBURST 軟件進行分析，人工校對后將7個管家基因序列通過MLST數據庫（http：//www.mlst.net）進行比對，獲得每個管家基因的等位號碼，綜合所有等位號碼來確定序列型別。獲得ST型別后用eBURST軟件進行克隆型聚類分析。

2 結果

2.1 SCCmec基因分型結果

55株MRSA中，SCCmecⅡ型3 2株（58.18%）、SCCmecⅤ型14株（25.45%）、SCCmecⅢ型6株（10.91%）、SCCmecⅠ型1株（1.82%）、無明確型別2株。SCCmec基因多重PCR擴增產物電泳圖見圖1。

圖1 部分MRSA SCCmec多重PCR擴增產物電泳圖

2.2 MLST基因分型結果

55株MRSA中，共檢出10個基因型，ST59為優勢型別（28株），以下依次為ST239和ST72（各6株）、 ST630（5株）、ST398（4株）、ST25（2株）、ST5和ST15（各1株），另發現2個可能新型別（已提交給分子分型和微生物基因組多樣性公共數據庫，尚未得到反饋）。

2.3 MLST聯合SCCmec基因分型結果

55株MRSA中，ST59-MRSA-SCCmecⅡ型為優勢型別，共檢出22株（38.18%）；其次為T59-MRSA-SCCmecⅤ型和ST72-MRSASCCmecⅡ型，各檢出6株（10.91%），檢出率居第3位的是ST239-MRSA-SCCmecⅢ型，檢出4株（7.27%）。見表1。

表1 MLST聯合SCCmec基因分型結果

2.4 體外藥物敏感性試驗結果

55株MRSA對利奈唑胺、萬古霉素和替加環素均敏感，對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為81.82%、78.18%，見表2。ST59型和ST239型對喹諾酮類、慶大霉素、利福平耐藥率差異較大，ST59型MRSA對環丙沙星、慶大霉素的耐藥率均僅為3.57%，未檢出左氧氟沙星、莫西沙星、利福平耐藥菌株；而ST239型MRSA對上述抗菌藥物的耐藥率均為83.33%；ST72型MRSA除對紅霉素、克林霉素高水平耐藥外，未檢出對其他抗菌藥物耐藥菌株；ST239型MRSA對紅霉素和克林霉素的耐藥率（66.67%）低于ST59型（85.71%）和ST72型（83.33%）；見表3。

表2 MRSA對12種常用抗菌藥物的藥物敏感性試驗結果 株（%）

表3 主要MLST型別MRSA對12種抗菌藥物的耐藥率 %

3 討論

本研究對內蒙古呼倫貝爾地區55株MRSA進行SCCmec、MLST基因分型和抗菌藥物敏感性試驗，旨在了解本地區MRSA的耐藥譜和分子流行病學特征。

SCCmec基因盒現分為11個型別，其中Ⅱ和Ⅲ型是醫院感染MRSA的常見類型，含有甲氧西林耐藥基因（mecA基因）和其他抗菌藥物耐藥基因[4]。本研究結果顯示，55株MRSA以SCCmecⅡ型為主（58.18%），SCCmecⅤ型占25.45%，SCCmecⅢ型占10.91%，SCCmecⅠ型占1.82%，無明確型別占3.64%。這與我國大部分地區以SCCmecⅢ型為主的情況不一致，與延邊地區（65.0%）、大連（56.7%）、沈陽（50.0%）[5-6]以SCCmecⅡ型為主相似，可能和這3個地區與內蒙古呼倫貝爾地區毗鄰有關。

本研究結果顯示，ST59-MRSA-SCCmecⅡ型M R S A為呼倫貝爾地區的主要流行株（38.18%）。MLST共檢測出10個基因型，ST59為優勢型別（50.91%），可能為呼倫貝爾地區的流行克隆株，這與相關文獻報道的ST239-MRSA為最流行基因型[7-9]不一致。有研究結果表明，2016年我國MRSA最流行基因型已經發生改變，ST239-MRSA的檢出率由2013年的42.4%降至2016年的11.6%（P＜0.001），ST59型和ST5型已經成為最常見的基因型[10]，與本研究結果一致。

本研究55株MRSA的藥物敏感性試驗結果與CHINET的統計結果相比，除對克林霉素的耐藥率（78.18%）略高于全國水平（66.7%）外，對其他的抗菌藥物的耐藥率均低于全國水平，尤其是對環丙沙星和左氧氟沙星這2種喹諾酮類藥物[11]。比較耐藥譜間的差異后發現，本地區的流行株ST59對環丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平的敏感率較高，體現出MRSA耐藥譜的地域特異性。

目前，MRSA的高耐藥率仍是臨床面臨的嚴峻挑戰。本研究分析了呼倫貝爾地區MRSA的分子流行病學特征，有助于為本地區MRSA的臨床治療、感染控制以及暴發流行監測提供科學的參考。