阿片相關雄激素缺乏癥的外周機制及胰島素樣生長因子1的治療作用

黃堅堅，陳星馳，崔燕華，周江平，南海函，郝欣蕊，林 函

〔1.溫州醫科大學附屬第二醫院、育英兒童醫院麻醉與圍術期醫學科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學檢驗醫學院（生命科學學院），浙江 溫州 325035〕

阿片類藥物作為世界衛生組織癌痛三階梯鎮痛方案中不可或缺的一部分，主要用于第二和第三階梯的治療［1］。近10年來，阿片類藥物也廣泛應用于慢性非癌性疼痛的治療。然而，隨著其臨床應用的持續增加，相關不良反應的發生率如阿片相關雄激素缺乏癥（opioid-induced androgen deficiency，OPIAD）也持續增加，主要表現為睪酮水平低下、性欲降低、男性勃起功能障礙、疲勞、情緒低落、潮熱和骨質疏松等［2-3］。研究發現，長期使用阿片類藥物治療的慢性疼痛患者會出現OPIAD［4］，嚴重影響了男性患者的情緒和生活質量。對于長期使用阿片類藥物鎮痛并出現OPIAD的患者，睪酮全身替代治療是主要的治療方法，但替代治療有著諸多禁忌證，包括前列腺癌、有下尿路癥狀的良性前列腺增生、血細胞比容＞50%和心功能較差者等，同時也存在相關并發癥，如紅細胞增多癥、睡眠呼吸暫停、痤瘡、少精不育和亞臨床前列腺癌等［5-6］。目前關于OPIAD機制研究主要集中在中樞機制，涉及外周機制的研究較少，如能明確OPIAD的外周機制，并采用局部用藥進行治療，則能避免替代治療的不良反應，為OPIAD的治療提供新方法。

離體研究證明，胰島素樣生長因子1（insulinlike growth factor 1，IGF1）在睪酮合成過程中也發揮著重要的作用，能有效改善氟化物引起的睪酮水平下降［7］。本研究通過小鼠在體及離體實驗，初步探討OPIAD的外周機制及驗證IGF1治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物

90～120日齡健康雄性C57BL/6小鼠，20～30 g，動物許可證：SYXK（浙）2019-0009，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠每籠4～6只飼養，溫度23～25℃，相對濕度40%～50%，光照時間07:00～19:00，自由飲食飲水。實驗動物的使用均獲得溫州醫科大學實驗動物管理機構倫理審查許可。

1.2 藥品、試劑和儀器

阿片μ受體激動劑DAMGO，英國Tocris公司；IGF1，美國PeproTech公司；IGF1受體拮抗劑鬼臼苦素（picropodophyllin，PPP），美國MCE公司；鹽酸嗎啡，東北制藥集團股份有限公司；DMEM/F12和青、鏈霉素，美國Gibco公司；7.5%牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司；DMSO，美國Sigma公司；Trizol和引物，美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒，日本Takara公司；熒光定量PCR試劑盒，德國Qiagen公司；乙腈、甲醇和異丙醇（色譜純），德國Merck公司；甲酸，美國Fisher公司；睪酮標準品和睪酮-D3，比利時Acros公司；IGF1酶聯免疫檢測試劑盒，美國R&D Systems公司。PCR擴增儀，美國Bio-Rad公司；超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography mass spectrometry，UPLC-MS）儀 和 Waters Acquity UPLC HSSC18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），美國Waters公司；多功能酶標儀，美國Bio-Tek公司。

1.3 小鼠實驗

1.3.1 分組、藥物處理和樣品制備

將16只小鼠隨機分為正常對照組和嗎啡組（n=8），分別sc給予嗎啡5 mg·kg-1［8］或同體積生理鹽水。4 h后，小鼠麻醉后摘眼球取血，置室溫靜置10～20 min，4℃，626×g離心 20 min，取血清，-40℃保存。收集睪丸，去除睪丸表面的白膜及其他組織，加入1 mL預冷的PBS（pH 7.4），于冰上手動研磨制成組織勻漿，4℃，626×g離心20 min，取上清，-40℃冷凍待測。按照BCA試劑盒說明書檢測睪丸勻漿總蛋白濃度。

1.3.2 UPLC-MS法檢測小鼠血清和睪丸組織中睪酮含量

用甲醇配制不同濃度的睪酮標準品。分別取1.3.1制備的血清、睪丸組織勻漿或睪酮標準品100 μL，加入10 μL內標（睪酮-D3樣品，10 μg·L-1），渦旋2 min混勻，隨后加入200 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋3 min后4℃，13 523×g離心10 min，取上清進行UPLC-MS分析。液相色譜條件如下：色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫30℃，樣品室溫度 10℃，進樣體積10 μL，流速0.4 mL·min-1。流動相：0.1%甲酸（流動相A）+乙腈（流動相B），采用梯度洗脫。質譜條件：電離方式為ESI+，毛細管電壓3 kV，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃，脫溶劑氣流量1000 L·h-1，錐孔氣流量50 L·h-1，錐孔電壓38 V，碰撞氣為氬氣，碰撞能量22 V。洗脫程序：0～1 min，40%B；1.1～2.5 min，40%B～90%B；2.6～4 min，90%B～40%B。以相應濃度的標準品與內標峰面積的比值經加權線性回歸法得到標準曲線方程，并根據其計算血清和睪丸勻漿樣品中的睪酮含量［9］。睪丸勻漿中睪酮含量（ng·g-1）=睪酮含量（ng·L-1）/睪丸勻漿總蛋白含量（g·L-1）。

1.3.3 ELISA檢測小鼠血清和睪丸組織中IGF1含量

取1.3.1制備的血清和睪丸勻漿，按照ELISA試劑盒說明書檢測IGF1含量。睪丸勻漿中IGF1含量（μg·g-1）=IGF1含量（μg·L-1）/睪丸勻漿總蛋白含量（g·L-1）。

1.4 小鼠睪丸曲細精管離體培養

1.4.1 組織分離和培養

將雄性C57BL/6小鼠處死后在無菌條件下取睪丸，去除睪丸周圍的附睪及結締組織，置于預冷的DMEM/F12中，分別經75%乙醇浸泡消毒1次、PBS清洗2次，隨后將睪丸置于裝有培養基的玻璃培養皿中，去除外層白膜，分離睪丸組織為長短大致相同的單根曲細精管。在24孔板或48孔板中分別加入500或300 μL培養基（DMEM/F12+0.1%BSA），將曲細精管移至培養板中，保證各孔中曲細精管數量相同，置34℃，5%CO2培養箱培養24 h，而后進行相應分組和藥物處理。于藥物處理前分別測定組織培養基中睪酮和IGF1的基礎含量。實驗重復3次，每組設6復孔。

1.4.2 UPLC-MS法檢測IGF1對睪酮合成的時效作用

將睪丸曲細精管分為正常對照組和IGF1組，分別給予生理鹽水或IGF1 100 μg·L-1進行孵育，于孵育12，24或48 h后收集培養基，同1.3.2檢測睪酮含量。以藥物處理后的睪酮含量與基礎含量的比值表示睪酮相對含量。

1.4.3 ELISA檢測DAMGO對IGF1合成分泌的影響

將睪丸曲細精管分為正常對照組和DAMGO組［10］，分別給予生理鹽水或 DAMGO 10 μmol·L-1，培養48 h后收集培養基，同1.3.3檢測IGF1含量。以藥物處理后IGF1含量與基礎含量的比值表示IGF1相對含量。

1.4.4 UPLC-MS法檢測IGF1對DAMGO睪酮合成抑制作用的影響

將睪丸曲細精管分為正常對照組（給予生理鹽水）、IGF1組（加入IGF1 100 μg·L-1）、DAMGO 組（加入 DAMGO 10 μmol·L-1）和 IGF1+DAMGO 組（同時加入IGF1 100 μg·L-1和DAMGO 10 μmol·L-1），培養48 h后收集培養上清，同1.3.2檢測睪酮含量。

1.4.5 熒光定量RT-PCR檢測睪丸曲細精管組織睪酮合成相關酶mRNA表達水平

實驗分組和給藥同1.4.4。藥物處理后收集曲細精管，Trizol法提取收集的曲細精管RNA，并測定其濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將RNA逆轉錄為cDNA，隨后按照熒光定量RT-PCR試劑盒說明書操作，檢測睪酮合成相關酶—清道夫受體B1（scavenger receptor B-1，Scarb1）、類固醇合成急性調節蛋白（steroidogenic acute regulato?ry protein，Star）、膽固醇側鏈裂解酶（cholesterol side chain cleavage enzyme，Cyp11α1）、17α-羥化酶1（17α-hydroxylase-1，Cyp17α1）、3β-羥化類固醇脫氫酶1（3β-hydroxysteroid dehydrogenase-1，3βHsd1）和17β-羥基類固醇脫氫酶3（17β-hydroxys?teroid dehydrogenase-3，17βHsd3）mRNA水平，引物序列見表1。熒光定量RT-PCR的反應條件：預變性（95℃，2 min），變性（95℃，5 s）、退火及延伸（60℃，10 s），共40循環，最后65℃延伸5 s。采用雙標準曲線法檢測樣本中各睪酮合成相關酶mRNA相對表達水平。

1.4.6 UPLC-MS法檢測IGF1促進睪丸曲細精管合成睪酮的受體特異性

將睪丸曲細精管分為正常對照組（給予生理鹽水）、溶劑對照組（加入0.01%DMSO）、PPP組（加入 IGF1 受體特異性拮抗劑 PPP 1 μmol·L-1［11］）、IGF1 組（加入 IGF1 100 μg·L-1）和 PPP+IGF1 組（加入 PPP 1 μmol·L-1孵育 2 h 后，再加入 IGF1 100 μg·L-1共同培養 24 h），藥物處理后收集培養基，同1.3.2檢測睪酮含量。

Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.5 統計學分析

實驗結果數據用±s表示，采用SPSS18.0統計軟件進行數據統計處理分析。IGF1時效作用實驗采用重復測量方差分析，2組比較采用成組樣本t檢驗；3組及以上采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 嗎啡對小鼠血清和睪丸組織中睪酮和IGF1含量的影響

UPLC-MS和ELISA檢測結果顯示，雄性成年小鼠sc給予嗎啡5 mg·kg-14 h后，與正常對照組比較，嗎啡組小鼠血清和睪丸勻漿中的睪酮含量（圖1A和1C）和IGF1含量（圖1B和1D）均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Contents of testosterone and insulin-like growth factor 1（IGF1）in serum and testicular homogenate.C57BL/6 mice were sc given morphine（5 mg·kg-1）or saline for 4 h.The testosterone contents of serum（A） and testicular homogenate（C）in mice were measured by ultra performance liquid chromatography mass spectrometry（UPLC-MS），and the IGF1 contents in serum（B）and testicular homogenate（D）were measured by ELISA.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 IGF1對曲細精管睪酮合成的時效的影響

UPLC-MS檢測結果顯示（圖2），與正常對照組相比，離體培養的睪丸曲細精管經IGF1 100 μg·L-1孵育12 h后，IGF1組培養基中睪酮相對含量無明顯變化；而孵育24和48 h后，IGF1組培養基中睪酮相對含量明顯增加（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of different durations of IGF1 treatment on relative testosterone content in seminiferous tubules culture supernatant detected by UPLC-MS.The seminif?erous tubules were isolated from male C57BL/6 mice and treated with IGF1 100 μg·L-1for 12，24 and 48 h.Relative testosterone content was the ratio of testosterone content after drug treat?ment to the basic content.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 DAMGO對曲細精管合成分泌IGF1的影響

ELISA檢測結果顯示，與正常對照組（0.57±0.11，n=3）比較，DAMGO組培養基中IGF1相對含量（0.26±0.01，n=3）顯著降低（P＜0.01），提示DAMGO抑制曲細精管合成分泌IGF1。

2.4 IGF1對DAMGO抑制睪酮合成的影響

UPLC-MS檢測結果顯示（圖3），與正常對照組相比，IGF1組離體睪丸曲細精管培養基中睪酮相對含量明顯升高（P＜0.01），DAMGO組培養基中睪酮相對含量降低（P＜0.05）；與 DAMGO 組相比，IGF1+DAMGO組培養基中睪酮相對含量顯著上升（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of IGF1 on relative testosterone content induced by DAMGO detected by UPLC-MS.The seminif?erous tubules were isolated and divided into normal control group，IGF1 group（IGF1 100 μg·L-1），DAMGO group（DAMGO 10 μmol·L-1）and IGF1+DAMGO group（DAMGO 10 μmol·L-1 and IGF1 100 μg·L-1）.Drugs were incubated or co-incubated for 48 h，respectively.±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with DAMGO group.

2.5 IGF1及DAMGO處理對離體曲細精管組織中睪酮合成相關酶mRNA水平的影響

熒光定量RT-PCR結果（圖4）顯示，與正常對照組相比，IGF1組和IGF1+DAMGO組Star和17βHsd3mRNA水平顯著增加（P＜0.05）（圖4B和4F），DAMGO組3βHsd1mRNA表達水平明顯降低（P＜0.01）（圖4E）；而與DAMGO組相比，IGF1+DAMGO組Star和17βHsd3mRNA表達顯著增加（P＜0.05）（圖4B和4F）；其余各基因表達水平在各組間無明顯改變。

Fig.4 Effects of IGF1 and DAMGO on mRNA levels of testosterone synthesis-related enzymes in seminiferous tubule tissue by qPCR.See Fig.4 for the treatment.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DAMGO group.

2.6 IGF1促進睪丸曲細精管合成睪酮的受體特異性

UPLC-MS檢測結果顯示（圖5），離體睪丸曲細精管經IGF1和PPP單獨或聯合孵育后，與正常對照組相比，IGF1組培養上清中睪酮相對含量明顯升高（P＜0.01）；與溶劑對照組相比，PPP組和PPP+IGF1組培養上清中睪酮相對含量無明顯變化；與PPP組相比，PPP+IGF1組培養上清中睪酮相對含量無明顯變化；與IGF1組相比，PPP+IGF1組培養上清中睪酮相對含量明顯降低（P＜0.01）。

Fig.5 Effects of IGF1 and picropodophyllin（PPP）on relative testosterone content in culture superna?tant of seminiferous tubules detected by UPLC-MS.The seminiferous tubules were isolated and divided into normal control group，vehicle group（0.01%DMSO），IGF1 group（IGF1 100 μg·L-1），PPP group（PPP 1 μmol·L-1），and PPP+IGF1 group.The PPP+IGF1 group was incubated with PPP 1 μmol·L-1 for 2 h，then co-incubated with IGF1 100 μg·L-1for 24 h.The other groups were incubated with diffrent drugs or vehicles for 24 h，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with IGF1 group.

3 討論

阿片類藥物主要通過μ，κ和δ等阿片受體產生作用［12］，其中阿片μ受體作為經典的G蛋白偶聯受體，除廣泛分布于下丘腦、垂體等中樞神經系統外，在其他組織細胞中也有分布。較多的研究結果顯示，在人和嚙齒類動物睪丸組織中，成熟的精子、精原細胞和巨噬細胞等均表達阿片μ受體［13-14］。另外，Fabbri等［15］發現，睪丸支持細胞和未成熟的睪丸間質細胞表面表達了大量的阿片μ受體，然而成熟的睪丸間質細胞表面卻并不表達阿片μ受體。本研究首先通過成年小鼠sc給予嗎啡，發現小鼠血清和睪丸勻漿中睪酮和IGF1水平均顯著下降，提示嗎啡可能通過中樞機制和（或）外周機制抑制睪酮和IGF1的分泌。嗎啡抑制睪酮合成的中樞機制主要通過下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamic-pitu?itary-gonadal axis，HPG）調控，阿片類藥物可作用于下丘腦μ受體，減少下丘腦釋放促性腺激素釋放激素，抑制垂體合成分泌黃體生成素和卵泡刺激素，或直接作用于垂體的阿片μ受體，減少黃體生成素和卵泡刺激素的分泌，進而干擾機體睪酮的合成［16］。而關于阿片類物質影響睪酮合成分泌的外周機制目前尚未明確，有研究者發現，在未成年大鼠睪丸內局部注射腦啡肽可抑制睪酮分泌，提示阿片類物質可能通過外周機制調控睪酮的合成分泌［17］，但整體動物睪丸內局部注射模型并不能完全排除中樞機制的干擾。本研究采用了離體曲細精管培養模型，可以相對保留睪丸原有微環境的同時，避免了HPG軸對睪酮合成分泌的中樞調控［18］，有利于OPIAD的外周機制探討及驗證IGF1外周治療作用。研究結果發現，在離體曲細精管模型中，DAMGO明顯抑制睪酮及IGF1的合成分泌，表明OPIAD存在相應的外周機制。

IGF1是一種在分子結構上與胰島素類似的多肽物質，主要由肝合成釋放［19］，能與IGF1受體結合，在兒童的生長發育和機體的物質合成代謝中起重要調控作用。2005年，美卡舍明（重組人胰島素樣生長因子1）通過美國FDA的批準作為嚴重原發性IGF1缺乏癥治療藥進入臨床，但因其全身注射具有較多的不良反應，如缺鐵性貧血、淋巴結病、扁桃體腫大、甲狀腺腫大和關節痛等，使美卡舍明的臨床應用范圍變得十分狹窄［20］。如果局部注射IGF1對OPIAD具有外周治療作用，則能避免IGF1全身給藥的副作用，開辟新的臨床應用前景。目前臨床上對于睪丸鞘膜積液等疾病的治療，也可以使用局部外周注射的方式，通過睪丸鞘膜內注射相應藥物，減少細胞浸潤和炎性滲出等，同時刺激鞘膜腔形成無菌性粘連，從而治愈鞘膜積液［21］。另外，關于局部睪丸透皮給藥貼劑的專利也早有報道，如1989年美國Campbell等［22］的睪丸透皮給藥裝置，均提示睪丸外周局部治療具有很好的可行性及實用性。

在睪丸組織中，IGF1可由睪丸間質細胞、生精細胞及巨噬細胞等合成分泌［23］，睪丸內合成分泌的IGF1可通過旁分泌或自分泌作用調控上述3種細胞或其他細胞的功能［24-25］。有研究表明，IGF1能明顯降低睪丸間質細胞的凋亡率并促進未成熟睪丸間質細胞合成睪酮［26］，而將小鼠全身Igf1基因敲除后，基因敲除小鼠血清中睪酮水平較野生小鼠明顯降低［27］。本研究發現，在離體OPIAD模型中，IGF1能逆轉DAMGO所引起的睪酮水平降低，提示IGF1在OPIAD治療方面的重要作用。胰島素受體、IGF1受體及IGF2受體在睪丸組織中廣泛分布，睪丸支持細胞、間質細胞和生殖細胞上均有它們的存在［28］，與IGF1有一定的親和力。本研究結果表明，IGF1可通過睪丸組織中的IGF1受體促進睪丸間質細胞合成睪酮。

另外，睪酮的合成與分泌過程涉及到諸多睪酮合成相關酶類如Scarb1，Star，3βHsd1，Cyp17α1，Cyp11α1和17βHsd3等。有研究表明，IGF1能增加Star基因的表達，而當敲除Igf1基因后，Scarb1，Star，Cyp17α1，Cyp11α1和17βHsd3 mRNA水平明顯降低［7，29］。本研究結果也發現，IGF1能顯著增強曲細精管組織中Star和17βHsd3 mRNA表達水平，對Cyp11α1，Cyp17α1，Scarb1和3βHsd1 mRNA水平則無影響。同時，經DAMGO處理后，曲細精管組織中的3βHsd1 mRNA表達水平明顯降低，而Cyp11α1，Cyp17α1，Scarb1，17βHsd3和Star mRNA表達水平則無明顯變化。

本研究采用IGF1對OPIAD進行外周治療的方法，未見文獻報道。然而本研究依舊存在些許不足之處，如睪丸組織中各類細胞上是否存在阿片μ受體，阿片類藥物以及IGF1具體作用于睪丸中何種細胞上的受體產生相應的生物學效應，其他類型的阿片受體是否參與OPIAD的外周機制，這些是后續研究應解決的關鍵性問題。

綜上所述，在整體動物和離體組織培養實驗均表明，OPIAD存在中樞和外周2種機制。阿片類藥物直接作用于睪丸組織上的阿片μ受體，抑制3βHsd1等睪酮合成相關酶mRNA表達，減少睪酮和IGF1的合成分泌，IGF1能直接通過睪丸組織中的IGF1受體，促進Star和17βHsd3 mRNA表達，從而對OPIAD產生相應的治療作用。