熱休克蛋白90 靶向抑制劑多肽P7 聯(lián)合替莫唑胺協(xié)同抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用*

薛瞳瞳，黃 薇，楊 楠，劉雁勇

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100005）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性原發(fā)性腫瘤［1］，其中位生存期僅 5 個(gè)月，5 年生存率僅5%。在世界衛(wèi)生組織對(duì)腦膠質(zhì)瘤的分級(jí)中，GBM 被評(píng)為Ⅳ級(jí)，惡性程度最高，復(fù)發(fā)率極高，預(yù)后極差。替莫唑胺（TMZ）為烷基化藥物，是目前治療 GBM 的首選藥物［2］，作用機(jī)制為通過(guò)釋放活性烷基化物質(zhì)造成DNA 甲基化，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，療效顯著，但復(fù)發(fā)性耐藥是限制其中長(zhǎng)期療效的一大阻礙［3］。熱休克蛋白 90（Hsp90）是重要的原癌信號(hào)交匯點(diǎn)［4］，在腫瘤組織中表達(dá)水平較正常組織高2 ～10 倍。Hsp90 參與維持 400 多種客戶蛋白的正常折疊和構(gòu)象穩(wěn)定，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制細(xì)胞凋亡［5］。多項(xiàng)研究顯示，Hsp90 抑制劑與抗腫瘤藥物聯(lián)用能發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用［6－7］。課題組前期通過(guò)噬菌體展示技術(shù)成功篩選出一種具備完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的多肽P7（序列LPLTPLP），P7 能特異性地識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)的 Hsp90，并促進(jìn) Hsp90 的降解［8］。為此，本研究中探討了P7 與TMZ 聯(lián)合給藥提高GBM 治療敏感性的效果及相關(guān)機(jī)制，為靶向化學(xué)藥聯(lián)用治療GBM 提供了新的研究思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：F50 型酶標(biāo)儀（上海三科儀器有限公司）；Accuri C6 型流式細(xì)胞儀（美國(guó) BD 公司）；DYY －7C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Tanon 5800 型化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能公司）。

試藥：TMZ（上海陶素生化科技有限公司，規(guī)格為25 mg，純度為 99.00%，CAS 號(hào)為 85622 －93 －1）；多肽P7（上海吉爾生化公司）；凋亡檢測(cè)試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司）；cleaved caspase－ 3 抗體、cleaved caspase － 9 抗體（Cell Signaling Technology 公司）。人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心）。MEM－EBSS 培養(yǎng)基（邁晨科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

U87MG 在5%CO2、溫度37 ℃條件下，置含10%胎牛血清、1% 非必需氨基酸和 1% 青鏈霉素雙抗的MEM－EBSS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè)

采用CCK－8 法檢測(cè)細(xì)胞活性。以每孔3 000 個(gè)的密度接種U87MG 細(xì)胞于96 孔板中，過(guò)夜貼壁后分組給藥。TMZ 組：0 ～ 1 mmol／L 共設(shè) 8 個(gè)濃度梯度；P7 組：0 ～ 500 μmol／L 共設(shè) 8 個(gè)濃度梯度；聯(lián)合給藥組：10，50，100 μmol／L 的 P7 分別與 7 個(gè)不同濃度梯度的 TMZ（0 ～ 1 mmol／L）以固定濃度比例（1 ∶1，1 ∶2，2 ∶1）聯(lián)用。加藥處理培養(yǎng)72 h 后，加入CCK－8 試劑，37 ℃避光孵育1.5 h，以酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，并計(jì)算存活率。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

以流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)U87MG 細(xì)胞凋亡情況。以每孔106個(gè)的密度接種U87MG 細(xì)胞于10 cm 培養(yǎng)皿中，過(guò)夜貼壁后分組給藥。對(duì)照組：僅予溶劑；P7 組：100 μmol／L；TMZ 組：400 μmol／L；聯(lián)合給藥組：P7 100 μmol／L ＋TMZ 400 μmol／L。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，收集細(xì)胞，采用凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行Annexin Ⅴ和PI 染色，樣品處理完畢后，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并計(jì)算凋亡率。

1.2.4 蛋白定量分析

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)凋亡標(biāo)志物cleaved caspase－3 和 cleaved caspase－9 的表達(dá)水平。細(xì)胞接種及分組給藥同1.2.3 項(xiàng)，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白提取，采用western blot 法檢測(cè)對(duì)U87MG 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響，使用Gel－Pro 分析軟件對(duì)蛋白條帶定量分析，目的條帶和內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graghpad Prism 8.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示。P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單用對(duì)U87MG 細(xì)胞存活率的影響

結(jié)果見(jiàn)圖 1。P7 和 TMZ 均能抑制 U87MG 細(xì)胞的生 長(zhǎng)，IC50值分別 為 （397.12 ±21.93）μmol／L 和（102.82 ± 11.72）μmol／L。

圖1 P7 與TMZ 單用對(duì)U87MG 細(xì)胞存活率的影響A.P7 B.TMZFig.1 Effect of P7 or TMZ alone on the survival rate of U87MG cells

圖2 P7 和TMZ 聯(lián)用對(duì)U87MG 細(xì)胞存活率的影響A.Survival profile B.TMZ equivalent diagramFig.2 Effect of P7 combined with TMZ on the survival rate of U87MG cells

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)U87MG 細(xì)胞存活率的影響

結(jié)果見(jiàn)圖2。聯(lián)用P7 后，原TMZ 生存曲線出現(xiàn)明顯左移，即 IC50值明顯降低（圖 2 A）。當(dāng) P7 與 TMZ 濃度比為 1 ∶1 和 1 ∶2 時(shí)，位于等效線下方，表明具有協(xié)同作用，且濃度比為1 ∶1 時(shí)的協(xié)同作用最明顯（圖2 B）。

2.3 聯(lián)合用藥對(duì)U87MG 細(xì)胞凋亡率的影響

結(jié)果見(jiàn)圖 3。P7 與 TMZ 單獨(dú)給藥后，U87MG 細(xì)胞凋亡比例略有上升，總凋亡率分別為 15.74% 和21.01% ，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異 （ P ＞ 0.05 ）。聯(lián)合給藥組的細(xì)胞總凋亡率與對(duì)照組相比顯著升高 （P ＝ 0.005 6 ＜ 0.05）。表明聯(lián)合給藥組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡更顯著。

圖3 P7 與TMZ 聯(lián)用對(duì)U87MG 細(xì)胞凋亡率的影響注：與對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與 P7 組比較，＃P ＜0.05。圖 4 同。A.Flow cytometry B.Data statisticsNote：Compared with those in the control group， *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01；compared with those in the P7 group， ＃P ＜ 0.05；as well as Fig.4.Fig.3 Effect of P7 combined with TMZ on apoptosis rate of U87MG cells

圖4 P7 和TMZ 聯(lián)用U87MG 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響A.Protein band B，C. Data statisticsFig.3 Effect of P7 combined with TMZ on the expression of apoptosis－related proteins in U87MG cells

2.4 聯(lián)合用藥對(duì)U87MG 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，單藥組 cleaved caspase－3 和cleaved caspase－9 相對(duì)表達(dá)水平均略升高，聯(lián)合給藥組均顯著升高（P ＝ 0.004 5，0.020），且均顯著高于 P7 單藥組（P ＝0.021，P ＝0.045）。詳見(jiàn)圖 4。

3 討論

目前，GBM 的臨床治療“金標(biāo)準(zhǔn)”是手術(shù)切除后放射治療聯(lián)合替莫唑胺治療［9－10］。與第 1 代抗 GBM 藥物（如卡莫司汀）相比，盡管TMZ 能顯著改善肺纖維化和骨髓抑制等問(wèn)題，但O6－甲基鳥嘌呤－DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）陽(yáng)性的 GBM 患者對(duì) TMZ 響應(yīng)極差［3］，長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生耐藥，影響藥效［11］。近年來(lái)，分子靶向治療成為研究熱點(diǎn)，但針對(duì)GBM 的靶向治療藥物厄洛替尼和吉非替尼的臨床獲益卻十分有限，其臨床失敗的原因是部分GBM 存在表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的突變和PTEN 基因缺失［12］。Hsp90 是一種重要的腫瘤治療標(biāo)志物，抑制Hsp90 會(huì)造成多種腫瘤相關(guān)的Hsp90 客戶蛋白失活［4］，從而對(duì)多條腫瘤相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用［13］。與其他單靶點(diǎn)藥物相比，Hsp90 抑制劑在一定程度上避免了信號(hào)通路代償問(wèn)題，可降低復(fù)發(fā)率［14］。TACAEI 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，17－AAG，17－DMAG，AUY922 等 Hsp90 抑制劑對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制效果，與化療藥物聯(lián)用能顯著提高化療藥物的敏感性，并降低其副作用［13］。

當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)產(chǎn)生后，pro－caspase 9 與 Apaf－1 結(jié)合，并促進(jìn)pro－caspase 9 被剪切生成cleaved caspase－9；活化的caspase－9 進(jìn)而促進(jìn)生成cleaved caspase－3，啟動(dòng) caspase 級(jí)聯(lián)激活［16］。本研究中發(fā)現(xiàn)，P7 與 TMZ 聯(lián)用對(duì)U87MG 細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用并能顯著上調(diào)cleaved caspase－9 和 cleaved caspase－3 的表達(dá)水平，顯著升高凋亡率，說(shuō)明多肽P7 和TMZ 的協(xié)同抑制作用與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，多肽P7 和化療藥物TMZ 聯(lián)用有協(xié)同增效作用，能抑制U87MG 細(xì)胞存活，這與激活caspase 級(jí)聯(lián)凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。本研究為改善TMZ 對(duì)GBM 的治療效果提供了新的研究思路。