他克莫司液相色譜串聯質譜試劑盒性能評價及臨床應用

杭 紅 ，邢 晗 ，張 天 ，朱 磊 ，李 宇 △

（1. 上海藥明奧測醫療科技有限公司，上海 200125； 2. 鄭州大學第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450052）

他克莫司（tacrolimus）又名FK506，屬鏈霉菌屬中分離出的大環內酯類新型免疫抑制劑，可通過抑制白細胞介素 2（IL －2）、γ 干擾素的釋放，抑制 T 淋巴細胞的增殖和活化，從而抑制免疫反應。他克莫司是肝臟、心臟、腎臟及骨髓移植患者的首選免疫抑制藥物，移植后排斥反應對傳統免疫抑制方案耐藥者，也可選用該藥［1－2］。近幾年，他克莫司也用于抑制潰瘍性結腸炎患者的炎性反應［3］。他克莫司的治療窗窄，且藥代動力學個體差異大，使用標準起始劑量后，有的患者由于血藥濃度低，未達到有效治療濃度而產生急性排斥反應；有的患者由于血藥濃度高而產生系列毒副反應，如肝腎毒性、神經毒性、血糖代謝紊亂、脂代謝異常等，因此臨床使用他克莫司需進行血藥濃度監測［4－5］。

目前用于測定全血中他克莫司血藥濃度的方法主要包括微粒子酶聯免疫法（MEIA）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、酶放大免疫測定法（EMIT）、液相色譜串聯質譜法（LC－MS／MS）等。免疫學方法所用單克隆抗體與他克莫司代謝物存在交叉反應，過高地估計了他克莫司的濃度，不適于其藥代動力學分析［6］。LC －MS ／MS 法測定結果為他克莫司原形藥物濃度，能更準確地說明藥物濃度－療效－不良反應三者間的關系。同時，LC－MS／MS 法具有分析時間短、樣本處理快速、特異性強、準確度高、靈敏度高、成本低等優點［7－8］，目前在國內外已成為監測患者他克莫司血藥濃度的主要方法。國內他克莫司血藥濃度的監測是基于各醫學實驗室的自建方法，溯源鏈及方法缺乏統一標準。另外，實驗室間的資質與能力有較大差距，給監管造成較大困難。同時，由于這些自建方法均未在《醫療機構臨床檢驗項目目錄（2013 版）》中，因此，其大規模開展面臨相關法規難題。本研究中根據體外診斷試劑（IVD）注冊法規的要求，開發了他克莫司LCMS／MS 試劑盒，產品溯源至美國藥典（USP），開展了試劑盒關鍵性能評價，并進行了方法學比對。現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY I－S 型超高效液相色譜串聯質譜系統（美國 Waters 公司）。

1.2 試藥

他克莫司標準品（USP，批號為R055E0；加拿大TLC Pharmaceutical Standards 公司，批號為 1418 －091A1；含量97.9%）；子囊霉素（加拿大 Toronto Research Chemicals 公司，批號為2－LWJ－45－1）；他克莫司測定試劑盒（蘇州藥明澤康生物科技有限公司）；兔全血（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、甲酸、甲酸銨均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為 0.1%甲酸4 mmol／L 甲酸銨水溶液（A）－ 0.1% 甲酸 4 mmol／L 甲酸銨甲醇溶液（B），梯度洗脫 （0 ～0.2 min 時 80%A，0.2 ～ 0.8 min 時 80%A→2%A，0.8 ～1.4 min 時 2%A，1.4 ～1.5 min 時 2%A→80%A，1.5 ～1.8 min 時80%A）；流速為 0.6 mL ／min，柱溫為 60 ℃，進樣量為 2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式，掃描類型為多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓為3.0 kV；去溶劑化溫度為500 ℃；去溶劑化流速為1 100 L／h，錐孔流速為150 L／h；霧化壓力為7.0 Bar。他克莫司及內標子囊霉素MRM 信息見表1。

表1 他克莫司及內標子囊霉素MRM 參數Tab.1 MRM parameters of tacrolimus and internal standard ascomycin

2.2 校準品和質控品制備

稱取他克莫司標準品（TLC 公司）適量，用甲醇溶解制成他克莫司質量濃度為1 mg／mL 的貯備液；用甲醇稀釋，得他克莫司次級貯備液（10 μg／mL）；采用兔全血稀釋，得他克莫司高濃度兔全血溶液（200 ng／mL）；再與空白兔全血通過稱重稀釋法得到校準點C6 溶液（50 ng／mL）；校準點C6 溶液與空白兔全血采用稱重稀釋法得到校準點 C1 至校準點 C5 溶液，質量濃度分別為 2，5，10，20，30 ng／mL。質控品配制工藝與校準品相同，由上述高濃度兔全血溶液與空白兔全血通過稱重稀釋法得到高濃度質控點（HQC）溶液（30 ng／mL）；HQC 溶液與空白兔全血采用稱重稀釋法得到低質量濃度質控點（LQC）溶液（6 ng／mL）和中質量濃度質控點（MQC）溶液（15 ng／mL）。

2.3 溯源鏈建立

他克莫司測定試劑盒校準品的溯源執行GB ／T 21415 － 2008 標準［9］。他克莫司校準品溯源至美國藥典他克莫司標準品。試劑盒以美國藥典他克莫司標準品建立溯源鏈，并以其為溯源鏈的終點。用美國藥典他克莫司標準品繪制標準曲線，對工作校準品進行定值，并以此建立的標準曲線對產品校準品進行定值（圖1）。在常規樣品檢測中，以產品校準品建立標準曲線，計算常規樣本中他克莫司和其內標峰面積比值，并代入校準曲線后得結果。

圖1 他克莫司試劑盒校準品溯源鏈Note：a represents one or more existing measurement systems calibrated with primary or secondary calibrators，and b represents one or more manufacturer working calibrators or higher calibrators calibration.Fig.1 The traceability chain of tacrolimus kit

2.4 精密度性能評價

參考美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）頒布的EP5－A2 標準進行精密度試驗，主要涵蓋室內精密度、批內精密度、批間精密度和日間精密度。每天從3 個生產批次的試劑盒中分別抽取2 盒，每個生產批次獨立進行試驗和數據分析。精密度試驗的樣本采用兔全血制備的溶液，包含低、中、高 3 個質量濃度（6，15，30 ng ／mL）。

試驗程序：1）2 位試驗員均分別檢測每個分析批次；2）每個分析批次從3 個生產批次中分別抽取1 盒待評價試劑盒，檢測高、中、低3 個質量濃度的精密度參考品，每個質量濃度重復測定2 次；3）獲得20 d 的有效數據，試驗分別由2 臺儀器間隔進行；4）最終每個質量濃度得到80 個檢測結果。統計每個分析批次各質量濃度下的批內及總精密度，分別用變異系數（CV批內、CV總）表示，反映試劑盒真實的精密度參數［見表2，表中 Sr為預估重復性標準差，ST為預估儀器內或室內精密度，為預估日間標準差，Srr為預估批間標準差），CV總＝，L，M，H 分別為低、中、高質量濃度企業參考品］。由表2 可知，試劑盒總精密度范圍在4.07% ～5.57%，符合法規規定的總精密度要求。

表2 他克莫司試劑盒精密度性能評價結果Tab.2 Performance evaluation of the precision of tacrolimus kit

2.5 臨床比對試驗

選擇120 例臨床樣本，以他克莫司檢測試劑盒為評價試劑，選擇參考實驗室方法為參比試劑進行方法學比對研究，評價試劑與參比試劑的相關性和一致性，同時評價EMIT 法試劑盒與參比試劑的相關性和一致性。EMIT 法采用均相酶免疫測定法來分析全血中他克莫司的濃度，檢測方法參考該試劑盒說明書進行。參考實驗室具有美國病理學會（CAP）認證的相關檢測資質，他克莫司檢測項目參考相關法規經嚴格的方法學驗證，符合CAP 的認證要求，臨床評價過程符合國家藥品監督管理局的法規規定。

針對120 例臨床樣本檢測值分別做散點圖進行相關性分析及一致性分析（Bland－Altman 分析，采用差值－均值圖）［10－13］。如圖 2 A 所示，以參比試劑檢測值（ X）為橫坐標、評價試劑檢測值（ Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程 Y1＝ 1.013 1 X1＋ 0.023 3，R2＝ 0.989 3，r ＝ 0.994 6≥0.975，表明兩方法相關性良好。

對比試劑（EMIT 法）與參比試劑臨床樣本檢測值的相關性分析見圖2 B。由于EMIT 法對120 例臨床樣本中的7 例檢測值超出其線性范圍的高點（30 ng／mL），因此EMIT 法與參比試劑檢測值的相關性及一致性分析以剔除7 例后的113 例樣本進行分析。以參比試劑檢測值（ X）為橫坐標、免疫法測定值（ Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y2＝ 20.922 2 X2＋ 2.427 2，R2＝0.677 0，r ＝ 0.822 8≤0.975，表明兩方法相關性較差。

評價試劑與參比試劑臨床樣本檢測值的一致性分析見圖3 A，以2 種方法測定的均值（X）為橫坐標、差值（Y）為縱坐標。考慮到抽樣誤差，上下 ±1.96 SD 2 條水平實線為一致性界限的95%置信區間上下限，中間實線代表2 種方法檢測值差值的均值。2 種方法檢測值差值均值為 0.23 ng ／mL，標準差為 0.77，差值一致性界限的可信區間為 －1.524 ～1.980 ng／mL，在一致性界限的可信區間內共有 117 個點，占 97.50%（117 ／120），滿足95%的點落在一致性界限內，表明評價試劑與參比試劑的測定結果一致性良好。

圖2 樣本他克莫司檢測方法間的相關性A.Evaluation and reference reagents B.EMIT and reference reagentsFig.2 Correlation analysis of different measuring methods of tacrolimus from clinical samples

圖3 樣本他克莫司檢測方法間的一致性A.Evaluation and reference reagents B.EMIT and reference reagentsFig.3 Consistency analysis of different measuring methods of tacrolimus from clinical samples

對比試劑（EMIT 法）與參比試劑臨床樣本檢測值的一致性分析見圖3 B，2 種方法檢測值差值的均值為1.30 ng／mL，標準差為 3.56，差值的一致性界限的可信區間為 －6.816 ～9.422 ng／mL，在一致性界限的可信區間內共有 106 個點，占 93.81% （106 ／113），未滿足95%的點落在一致性界限內，表明免疫法與參比試劑的測定結果一致性較差。

2.6 正確度性能評價

正確度的評價主要有以下2 種方式：1）與國家標準品（或國際標準品）的靶值進行比對，觀察對相應標準品檢測結果的偏差情況，評價試劑實測值與相應國家（國際）標準品的相對偏差應不超過±15%。2）使用配制的已知分析物濃度的樣本，檢測結果和配制后應得的靶值比較，計算回收率（應在 85% ～ 115% ）［14］。由于無他克莫司檢測的國家參考品，國際標準品也難以獲取，本研究中采用了第2 種方案，即制備已知質量濃度的20 例全血樣本，其質量濃度覆蓋方法的線性范圍，對臨床樣本進行編號及分裝后分別采用實驗室自建方法（參比試劑、LC－MS／MS 法）、質譜法試劑盒（LC －MS ／MS 法，評價試劑）、免疫法試劑盒（EMIT 法，對比試劑）進行雙份測定，統計評價試劑的正確度（回收率）。由表3 可見，評價試劑20 例樣本回收率為 93.1% ～97.9%，樣本檢測值正確度高，符合分析性能要求。

本研究中對LC－MS／MS 法和EMIT 法試劑盒與參比方法間的相關性進行了分析。質譜試劑盒與參比試劑樣本檢測值的相關性分析見圖4 A。以參比試劑檢測值（ X）為橫坐標，質譜試劑（評價試劑）檢測值（ Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y3＝1.034 3 X3－0.399，R2＝ 0.997 9，r ＝ 0.998 9≥0.975，表明 2 種方法相關性良好。圖4 B 中，以參比試劑檢測值（ X）橫坐標、免疫法檢測值（ Y）縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y4＝1.049 3X4＋1.364 2，R2＝0.974 6，r ＝0.987 2≥0.975，表明2 種方法相關性良好。免疫法與參比方法檢測值相比，偏差范圍為－3.2% ～29.9%，檢測值整體偏高，而質譜試劑盒與參比方法檢測值的偏差范圍為－10.9% ～7.7%，表明質譜法試劑盒檢測值的正確度優于免疫法。

3 討論

3.1 他克莫司試劑盒校準品溯源鏈

他克莫司測定試劑盒具有完整的溯源鏈，產品校準品溯源至美國藥典他克莫司標準品，能保證測量結果在不同時間、不同空間的可比性，以及產品質量的可控性和可延續性，從而保證診斷的正確。校準品的溯源性保證了他克莫司試劑盒在臨床評價中與參比試劑的相關性及一致性，在正確度性能評價中回收率為93.1% ～97.9%。

表3 他克莫司試劑盒正確度性能評價結果Tab.3 Performance evaluation of the accuracy of tacrolimus kit

3.2 他克莫司試劑盒的精密度

圖4 加標樣本他克莫司檢測方法間的相關性A.Spiked samples of evaluation and reference reagents B.Spiked samples of EMIT and reference reagentsFig.4 Correlation between the different measuring methods of tacrolimus from the spiked samples

精密度是體外診斷試劑基本分析性能之一，也是其他方法學評價的基礎。目前，國內外關于精密度性能評價的方案多種多樣，他克莫司測定試劑盒參考CLSI 頒布的EP5－A2 進行精密度評價，結果符合法規規定的精密度要求。

3.3 他克莫司不同檢測方法間的正確度與一致性

正確度是體外診斷試劑最重要的分析指標，是分析測量范圍、參考區間評價等試驗的基礎。一個可靠的檢測方法必須保證較高的準確度，即滿足正確度和精密度的要求。溯源鏈的建立保證了量值傳遞的正確度。

監測血藥濃度的傳統方法，如酶聯免疫法、化學發光法均為對待測物質進行間接檢測，各廠家抗體無法標準化，抗體間的交叉反應導致了特異性不足，影響了方法的準確度。質譜技術是測量分子質荷比的分析方法，是對檢測物質直接分析的技術，由于質譜檢測技術具有特異性好、靈敏度高、通量高等特點，已逐漸成為血藥濃度監測的“金標準”［15］。目前，LC － MS ／MS 法的操作細則還是以實驗室自建方法為主，缺乏標準化的規范操作規程，影響了臨床應用的推廣。按體外診斷試劑注冊法規要求開發的他克莫司LC－MS／MS 試劑盒，檢測結果的正確度和一致性高于免疫法。試劑盒的推廣將有利于精準調整劑量，實施個體化給藥，以減少毒副反應、排異反應的發生，為精準醫學賦能。