HPLC 法同時測定甘草酸二銨制劑中18 α 和18 β 甘草酸二銨含量*

張軼華，田曉彤，孫 婷，高燕霞，李 揮

（河北省藥品醫療器械檢驗研究院，河北 石家莊 050200）

甘草酸二銨是從甘草中分離、篩選的主要活性成分甘草酸的二銨鹽，具有非特異性抗炎、抗過敏、穩定溶酶體膜及免疫調節作用，其抗病毒作用尤為突出。甘草酸二銨有2 個18 位差向異構體，雖然二者的分子結構僅18 位手性碳原子構型不同，但其在理化性質、藥效學、藥動學、不良反應等方面均存在差異，且分離測定存在一定困難。現同時測定2 個差向異構體的方法有薄層色譜（TLC）法和氣相色譜（GC）法，其中 TLC 法靈敏度太低，而GC 法需要復雜的衍生化。現行標準中未對差向異構體進行分析［1］，雖有高效液相色譜（HPLC）法測定甘草酸差向異構體的報道，但這些方法［2－5］耐用性較差。本研究中建立了同時測定甘草酸二銨制劑中18 α甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨含量的HPLC 法，為深入研究這2 個差向異構體的區別提供了定性、定量依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，包括四元低壓梯度泵、全自動進樣器、柱溫箱和紫外檢測器（美國Dionex 公司）；XPR26 ／A 型電子天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）。

1.2 試藥

18 α 甘草酸二銨對照品（a 廠，批號為 120703，含量為 99.0% ）；18 β 甘草酸 二銨對照品 （a 廠，批 號為130106，含量為 99.5%）；甘草酸二銨膠囊（a 廠，批號分別為 100411，100412，100413）；注射用甘草酸二銨（b 廠、批號為 100131，c 廠、批號分別為 091103，100603，d 廠、批號為 110501，e 廠、批號分別為 1008213 －2，0909215 － 2，0810203 －1）；甘草酸二銨注射液（a 廠、批號分別為1003271，1004031，1004241，f 廠、批號為10060715，g 廠、批號分別為 0908021，1006131，h 廠、批號為 120111，i 廠、批號為 310060801，j 廠、批號分別為 08120601，10091801，10091802，k 廠 、批 號 為089131101，l 廠、批號為 090301）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：水 －60% 高氯酸溶液（48 ∶0.5，V ／ V，用氨水調pH 至 8.0） － 甲醇（48 ∶52，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：248 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

稱取18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨對照品各25 mg，精密稱定，置同一25 mL 容量瓶中，加甲醇－水（50 ∶50，V ／ V）溶解并定容，搖勻，即得混合對照品溶液。取膠囊劑型樣品10 粒，另2 種劑型樣品各5 瓶，內容物混勻，精密稱取（量取）約相當于甘草酸二銨25 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇 － 水（50 ∶50，V ／ V）溶解并定容，搖勻，即得供試品溶液。取3 種劑型樣品的輔料，以甲醇－水（50 ∶50，V ／ V）溶解制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰，陰性對照無干擾。理論板數以18α 甘草酸二銨、18β 甘草酸二銨峰計均大于1 500。分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

線性關系與檢測限考察：用流動相稀釋混合對照品溶液，制成質量濃度分別為 1.0，0.5，0.3，0.1，0.05，0.01，0.005 mg ／mL 的系列混合對照品溶液，按 2.1 項下色譜條件各進樣 20 μL，記錄色譜圖。分別以 18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨峰面積（Y）為縱坐標、進樣質量濃度（X，mg／mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y1＝ 37.826 X1＋ 0.737（r ＝ 0.999 7，n ＝ 7），Y2＝49.436X2＋0.248（r ＝0.999 3，n ＝7）。結果表明，18α甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨的質量濃度均在0.005 ～1.0 mg／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。以信噪比（S ／ N）＝ 3 計算 18 α 甘草酸二銨和 18 β 甘草酸二銨的檢測限，結果分別為 0.056 mg ／mL 和 0.082 mg ／mL。

圖1 高效液相色譜圖1.18 α － glycyrrhizic acid 2.18 β － glycyrrhizic acidA.Mixed reference solution B － D.Test solution（the batch numbers are 100411，100131，1003271）E.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗：分別取混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，測定峰面積。結果18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨峰面積的 RSD 分別為0.42%和 0.60%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取不同劑型樣品（批號分別為100411，0909215 －2，10091801），分別按 2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置 0，4，8，12，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果3 批樣品 中 的 RSD 分 別 為 0.56% 和 0.63% ，0.49% 和0.59%，0.62%和 0.69%（n ＝5），表明供試品溶液室溫下放置24 h 內基本穩定。

重復性試驗：取不同劑型（批號分別為100411，0909215 － 2，10091801）適量，分別按 2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果 3 批樣品中，18 α 甘草酸二銨和 18 β 甘草酸二銨含量平均值分別為 67.33% 和 33.72% ，66.32% 和32.98% ，67.25% 和 32.25% ，RSD 分別為 0.26% 和0.43% ，0.25% 和 0.48% ，0.61% 和 0.38% （n ＝ 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：分別取已知18α 甘草酸二銨和18β甘草酸二銨含量的不同劑型樣品（批號分別為100411，100131，1003271）各 9 份，分別加入低、中、高質量濃度的混合對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，并按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算2 種甘草酸異構體含量，并計算加樣回收率。結果見表1 至表3。

表1 甘草酸二銨膠囊加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test of Diammonium Glycyrrhizinate Capsules（n ＝ 9）

表2 注射用甘草酸二銨加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test of Diammonium Glycyrrhizinate for Injection（n ＝ 9）

2.4 樣品含量測定

結果見表4。

表3 甘草酸二銨注射液加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.3 Results of the recovery test of Diammonium Glycyrrhizinate Injection（n ＝ 9）

表4 樣品含量測定結果（%）Tab.4 Content determination of 18 α － glycyrrhizic acid and 18 β －glycyrrhizic acid in the samples（%）

3 討論

3.1 流動相選擇

預試驗中，流動相考察了1%冰醋酸－甲醇，3%冰醋酸－甲醇－四氫呋喃，3%冰醋酸－乙腈－四氫呋喃和3%冰醋酸－乙腈－四氫呋喃（用氨水調pH 至8.0），結果18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨均不能達到完全分離。在流動相為水－60%高氯酸溶液（48 ∶0.5，V ／ V，用氨水調 pH 至 8.0） － 甲醇（48 ∶52，V ／ V）時，18 α 甘草酸二銨和 18 β 甘草酸二銨完全分離，檢測出的雜質峰最多，且雜質分離效果最好。

3.2 18 α 甘草酸二銨和 18 β 甘草酸的組成比例

除f 企業注射液劑型中僅有18 β 甘草酸二銨外，其余廠家不同劑型樣品均為18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨共存，比例為 2 ∶1 ～ 7 ∶1 不等。甘草酸二銨提取自中藥甘草，2 種18 位差向異構體的比例不易控制，且由于現行標準中未對差向異構體的比例進行要求，故各廠家制劑中二者的組成也不盡相同。已有文獻報道，不同比例的18 α 甘草酸二銨和18 β 甘草酸二銨制劑藥理作用也不同［6－10］，因此亟須制訂可行的方法控制其含量。