c-FLIP不同單體沉默對重癥急性胰腺炎大鼠中性粒細胞凋亡的影響研究

李 鵬，夏春輝，馮 凱，李志強

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常見的急性腹部疾病，可分為輕度急性胰腺炎、中度重癥急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎(SAP)[1-2]。SAP病死率約為38.4%，常導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)，進而引起早期多器官功能不全綜合征(MODS)[3-4]。由于胰腺壞死和膿毒癥均可發展為晚期MODS；因此抑制SIRS,在SAP早期治療中至關重要。中性粒細胞是炎癥過程中的重要效應細胞，SIRS患者外周血中性粒細胞凋亡延遲，壽命延長并過度激活；可釋放大量炎性介質損傷正常組織和細胞，繼而加重SIRS病情，最終導致SAP發展成為了MODS[5-6]。

細胞型Fas相關死亡域樣白細胞介素-1β轉換酶抑制蛋白(c-FLIP)可通過競爭性結合受體相互作用蛋白1(RIP1)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)阻斷信號傳導形成和Caspase-8的活化，從而阻斷Fas介導的凋亡信號傳導，起到抑制凋亡的作用[7-8]。c-FLIP主要包括兩種單體型，即長c-FLIP(c-FLIPL)和短c-FLIP(c-FLIPS)，二者均能抑制死亡受體介導的細胞凋亡，但它們具有不同的生物學功能[6]。最新研究發現，c-FLIP與RIP1、Caspase-8、Fas相關死亡結構域蛋白(FADD)形成復合體，隨后可能產生三種不同的生物學效應，高表達c-FLIPS通過抑制Caspase-8的表達，加速釋放RIP1后激活壞死性凋亡通路[9-10]。目前尚無關于c-FLIP與SAP發病機制關系的報道，因此本研究擬探討c-FLIP不同單體沉默對SAP大鼠血液中性粒細胞凋亡的影響，為SAP的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD雄性大鼠60只，8周齡，體質量(230±10)g，購自山東大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(魯)2019-0002，動物使用許可證號：SYXK(魯)2019-0013，動物質量合格證號：HG5300176，動物飼養環境：溫度22～25℃，濕度50%～60%。

1.2主要試劑及儀器 RPMI 1640培養液(德國默克公司，批號：QW12014)；熱滅活新生牛血清(新西蘭Gibco公司，批號：26010-092)；青霉素、鏈霉素(美國sigma公司，批號CX1264、WS2547)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、增強的ECL化學發光試劑均購于上海碧云天公司(批號：JH12745、SD21458、C503021、SF10036)；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司，批號：EK206S、EK106)；逆轉錄試劑盒、聚偏二氟乙烯膜購自上海橋星貿易有限公司(批號：A4100、A6211)；SYBR Premix Ex TagTM Ⅱ熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司，批號：XS620147)；c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8、β-actin一抗、辣根過氧化物酶(HRP)耦聯的二抗均購自美國BD Biosciences公司(批號：B65487、B25416、B20126、B63544、B10018)。HF-240型全自動生化分析儀(泰安市康宇醫療器械有限公司)；CX23型顯微鏡(奧林巴斯公司)；FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)；NanoDrop 8000型分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)；7300型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；ChemiDocXRS+型凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3siRNA制備 參照c-FLIP的RefSeq序列及siRNA的設計原理，設計格式為AA19NTT、長度為21 bp的siRNA。由美國Ambion公司分別設計3條靶向于c-FLIPL及c-FLIPS單體基因不同位點的siRNA序列，即為：c-FLIP siRNA-NC、c-FLIPS siRNA、c-FLIPL siRNA。

1.4動物造模、分組及給藥

1.4.1動物造模：選取50只大鼠給予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉并固定，于劍突下約3 cm處腹壁正中分層剪開皮毛、腹肌，循胃、十二指腸球及降部，暴露胰腺區域，找到主胰管，以24 G靜脈套管針于主胰管對側腸蹙刺入腸腔，稍退出針芯，循乳頭將軟套管穿入主胰膽管約0.5 cm，動脈夾固定，另于主胰膽管上游近肝門處動脈夾鉗夾。3%牛磺膽酸鈉溶液30 mg/kg，以12 ml/h速度微量泵注入，注射后拔除套管針。為保證模型制作穩定，將牛磺膽酸鈉溶液中加入美蘭溶液1滴，注射成功時可清晰顯示胰管走行，并且藍色溶液未漏入腸腔[11]。

1.4.2動物分組及給藥：本次造模大鼠共死亡7只，造模成功率為86.00%(43/50)，隨機處死3只大鼠，并將剩余40只大鼠按隨機數字表法分為對照組、c-FLIP siRNA-NC組、c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組，每組10只。檢測4組大鼠血清淀粉酶、丙氨酸氨基轉移酶、血肌酐水平，獲取胰腺病理組織以確定SAP造模是否成功。另取10只大鼠為假手術組，假手術組大鼠將3%牛磺膽酸鈉溶液替換為生理鹽水，其余手術步驟同造模大鼠一致。假手術組無大鼠死亡，成功率100.00%。c-FLIP siRNA-NC組、c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組大鼠一次性尾靜脈注射對應siRNA溶液1 nmol/ml[前期預實驗得出c-FLIPS siRNA、c-FLIPL siRNA對SAP大鼠的半數有效量(ED50)為2 nmol/ml，以1/2 ED 50為本實驗作用劑量]，注射體積為10 ml/kg；假手術組、對照組尾靜脈注射等量生理鹽水，轉染后72 h進行后續的各項指標檢測。

1.5大鼠腹水量、血清淀粉酶測定及胰腺組織病理 3%戊巴比妥鈉腹腔注射(30 mg/kg)麻醉各組大鼠，開腹，記錄腹水量，獲取其胰腺組織和血液。3000×g離心分離血清后，采用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶水平。并將胰腺組織固定于4%甲醛中，石蠟包埋，4 μm連續切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后，用顯微鏡觀察并拍照。

1.6大鼠中性粒細胞分離、培養及凋亡水平測定 取各組大鼠下腔靜脈血液3 ml肝素抗凝，注入含有30 g/L葡聚糖的離心管中，混勻，于37℃恒溫水浴箱中靜置45 min，進行紅細胞自然沉降；取上層液至另一離心管，3000×g離心10 min，去上清；將沉淀重懸于含3%小牛血清的PBS中，再輕輕地鋪在等體積的淋巴細胞分離液上，水平離心機2000×g離心20 min，去上清加入1 ml無菌冰水30 s，溶解紅細胞；立即加入20 g/L 氯化鈉溶液1 ml充分混勻，恢復等滲，2000×g離心10 min，去上清；將沉淀以RPMI 1640培養液2000×g離心10 min洗2次；以含10%熱滅活新生牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml的RPMI 1640培養液懸浮細胞，調整細胞濃度為5×106/ml，培養24 h。培養結束后，收集細胞并用冰PBS洗滌，然后將細胞重懸于PBS，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，黑暗中孵育10 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。凋亡率=凋亡細胞數/(凋亡細胞數+正常細胞數)×100%。

1.7大鼠中性粒細胞中c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 mRNA水平測定 使用Trizol試劑從大鼠中性粒細胞中分離總RNA，并保存在80℃環境下，使用分光光度計測量RNA濃度和純度，所有樣品的OD 260/280為1.8～2.0，使用反轉錄試劑盒將總RNA合成cDNA。PCR反應在實時熒光定量PCR儀中進行，引物由杭州聯科生物技術股份有限公司合成。引物序列分別為c-FLIPS：正向5'-CCCTGGTCAAATTGCTTAACCT-3'，反向5'-TTATTCGTCCCTCTGTTTTATG-3'；c-FLIPL：正向5'-CAGTGTGACTAAATTGTTGTGACTGTGA-3'，反向5'-CTGTGACTGATGGTCCCTCTGTCTGTGT-3'；RIP1：正向5'-CTCGTGCTGACTGTGCTGATCGTATTGTCGTCGATG-CTAGCAA-3'，反向5'-CGGGTCGTGCGGCTAGTGGTCCCTCTGCCGTGTAAATGCTTG-3'；Caspase-8：正向5'-CTCATCGTAGTGCTAGCTAGTCTCCCGTAGTAC-3'，反向5'-CCGTAGTAGTCGATCCCTCTGTTCGCGCGTAGC-3；GAPDH：正向5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3'，反向5'-ACCAGGCGCCCAATACGTGA-3'。將循環程序設定為在95℃初始保持10 min，然后在95℃變性，持續15 s，共40個循環，在50℃退火和延伸30 s，在72℃延伸15 s。使用2-ΔΔCt方法分析c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 mRNA的相對表達，標準化為GAPDH。

1.8大鼠中性粒細胞中c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 蛋白水平測定 在RIPA裂解緩沖液中裂解中性粒細胞，并在4℃下以3000×g離心10 min，提取蛋白質上清液，BCA試劑盒測定蛋白質濃度。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳將總蛋白分級分離并轉移至聚偏二氟乙烯膜上，將膜在含有TBST緩沖液的3%新生牛血清白蛋白中封閉1 h，然后在4℃下與c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8、β-actin一抗(稀釋比均為1∶1000)孵育過夜，然后加入HRP耦聯的二抗(1∶5000稀釋)在室溫下孵育2 h，使用增強的ECL化學發光試劑檢測生成的蛋白質，并將其暴露在暗室中。使用ChemiDocXRS+系統掃描條帶，蛋白質水平的定量分析被標準化為β-actin水平。

2 結果

2.1大鼠腹水量、血清淀粉酶水平比較 與假手術組比較，對照組、c-FLIP siRNA-NC組腹水量、血清淀粉酶水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；但對照組與c-FLIP siRNA-NC組腹水量、血清淀粉酶水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組腹水量、血清淀粉酶水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；但c-FLIPS siRNA組與c-FLIPL siRNA組腹水量、血清淀粉酶水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠腹水量、血清淀粉酶水平比較

2.2大鼠胰腺組織病理比較 假手術組胰腺組織結構正常；對照組、c-FLIP siRNA-NC組胰腺組織壞死嚴重、崩解，胰腺細胞排列紊亂，可見大量炎性細胞浸潤；c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組壞死胰腺細胞減少，炎性細胞浸潤減少，但胰腺組織疏松紊亂。見圖1。

圖1 5組大鼠胰腺組織病理圖(HE×400)

2.3大鼠中性粒細胞凋亡率比較 5組大鼠的中性粒細胞凋亡率分別為假手術組(12.36±0.65)%、對照組(6.63±0.52)%、c-FLIP siRNA-NC組(6.78±0.45)%、c-FLIPS siRNA組(10.21±0.36)%、c-FLIPL siRNA組(10.45±0.45)%。與假手術組比較，對照組和c-FLIP siRNA-NC組中性粒細胞凋亡率降低，差異有統計學意義(P<0.05)；但對照組與c-FLIP siRNA-NC組中性粒細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組中性粒細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)；但c-FLIPS siRNA組與c-FLIPL siRNA組中性粒細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 mRNA表達水平比較 與假手術組比較，對照組和c-FLIP siRNA-NC組中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL mRNA表達水平升高，RIP1、Caspase-8 mRNA表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；但對照組與c-FLIP siRNA-NC組上述指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL mRNA表達水平降低，RIP1、Caspase-8 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。但c-FLIPS siRNA組與c-FLIPL siRNA組上述指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8 mRNA表達水平比較

2.5大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8蛋白表達水平比較 與假手術組比較，對照組和c-FLIP siRNA-NC組中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL蛋白表達水平升高，RIP1、Caspase-8蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；但對照組與c-FLIP siRNA-NC組上述指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組和c-FLIPL siRNA組中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL蛋白表達水平降低，RIP1、Caspase-8蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。但c-FLIPS siRNA組與c-FLIPL siRNA組上述指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖2。

圖2 5組大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8蛋白免疫印跡圖

表3 5組大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL、RIP1、Caspase-8蛋白表達水平比較

3 討論

機體內中性粒細胞凋亡為壞死性凋亡，是細胞壞死的一種可調控類型，在實驗性AP的發生發展中起著重要作用。本研究結果顯示，與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組腹水量、血清淀粉酶降低，中性粒細胞凋亡率升高；這提示沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL可明顯促進SAP大鼠血液中性粒細胞凋亡，進而對大鼠SAP具有明顯緩解作用。文獻報道，相同劑量的雨蛙素誘導大鼠AP模型，為急性水腫型胰腺炎，腺泡細胞以凋亡為主；并發現大鼠AP模型中存在c-FLIP的明顯激活，進一步用c-FLIP抑制劑作用于AP大鼠,發現腺泡細胞凋亡較少，臨床癥狀減輕，提示c-FLIP抑制劑對雨蛙素誘導的大鼠AP模型起到明顯的保護作用[12]。雨蛙素誘導的c-FLIP基因敲除大鼠AP模型中腺泡細胞壞死明顯減少，大劑量的膽囊收縮素可導致大鼠發生水腫型胰腺炎，并從中觀察到c-FLIP的激活，當特異性抑制c-FLIP時，大鼠胰腺中壞死的腺泡細胞明顯減少，AP炎癥反應減輕；提示壞死性凋亡c-FLIP激活可能是SAP加重的重要原因[13]。本研究結果顯示，假手術組胰腺組織結構正常；對照組和c-FLIP siRNA-NC組胰腺組織壞死嚴重、崩解，胰腺細胞排列紊亂，可見大量炎性細胞浸潤；c-FLIPS siRNA組和c-FLIPL siRNA組壞死胰腺細胞減少，炎性細胞浸潤減少，但胰腺組織疏松紊亂。也說明沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL對大鼠的SAP具有保護作用。

壞死性凋亡是一種腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導的RIP1調控的非Caspase依賴性細胞凋亡方式[14-15]。TNF-α與其受體腫瘤壞死因子受體-1結合后，誘導復合物I合成[16-17]；該復合物可抑制RIP1去泛素化，從而導致胞漿內FADD、RIP1和Caspase-8形成復合物；Caspase-8的存在阻止了RIP1與受體相互作用蛋白3結合，此時復合物誘導細胞發生經典形式的凋亡[18]。

在Caspase-8被抑制或不能有效激活時，有活性的RIP1與RIP3結合形成復合物，將導致細胞發生壞死性凋亡[19]。c-FLIP在結構上與Caspase-8相似，但無Caspase-8所具有的蛋白水解酶活性；傳統認為c-FLIP通過競爭性結合FADD和Caspase-8阻斷信號傳導形成和Caspase-8的活化，從而阻斷Fas介導的凋亡信號轉導，起到抑制凋亡的作用[20]。最新研究發現，高表達c-FLIPS通過抑制Caspase-8的表達，加速釋放RIP1后激活壞死性凋亡通路；高表達c-FLIPL可促進降解RIP1，四聚體解聚、凋亡與壞死性凋亡通路均被阻斷，細胞維持生存狀態[21]。c-FLIP低表達時，Caspase-8被激活，誘導細胞發生經典細胞凋亡[22]。目前為止,不同單體型c-FLIP對Caspase-8的調控機制還不完全清楚；但c-FLIP不同單體型對細胞凋亡、壞死等不同細胞狀態的轉化起重要作用。c-FLIP可能通過不同單體型對Caspase-8進行多重調控，在細胞經典凋亡與壞死性凋亡間的相互轉化發揮重要作用[23]。本研究結果顯示，與對照組和c-FLIP siRNA-NC組比較，c-FLIPS siRNA組、c-FLIPL siRNA組大鼠中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL mRNA和蛋白表達水平降低，RIP1 mRNA和蛋白、Caspase-8 mRNA和蛋白表達水平升高。說明了沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL能明顯抑制SAP大鼠血液中性粒細胞c-FLIPS、c-FLIPL mRNA和蛋白水平的表達，促進RIP1、Caspase-8 mRNA和蛋白水平的表達，進而激活壞死性凋亡途徑，這也與上述討論一致。

綜上所述，沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL可明顯促進SAP大鼠血液中性粒細胞凋亡并對SAP具有明顯緩解作用；其機制與沉默c-FLIP的兩種單體c-FLIPS、c-FLIPL能明顯抑制SAP大鼠血液中性粒細胞c-FLIPS mRNA和蛋白、c-FLIPL mRNA和蛋白水平的表達，促進RIP1 mRNA和蛋白、Caspase-8 mRNA和蛋白水平的表達，進而激活壞死性凋亡途徑有關。