天麻素抑制miR-223-3p對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞損傷的影響

劉早陽，任福強

肺炎是肺炎鏈球菌感染所致的呼吸系統主要疾病之一，已嚴重影響了患者的生活質量。肺泡上皮細胞具有屏障保護功能，其凋亡是引發肺炎的重要原因之一；因而如何減輕肺泡上皮細胞損傷已成為治療肺炎的關鍵。既往研究報道，部分中藥可減輕肺炎鏈球菌感染引起的肺泡上皮細胞損傷[1-3]。天麻素是我國中藥蘭科天麻屬植物天麻塊莖的主要提取物，其可抑制氧化應激從而減輕小鼠星形膠質細胞損傷[4]；表明天麻素可通過抑制氧化應激及炎癥反應等減輕細胞損傷，但其對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞損傷尚未可知。miR-223-3p在肺炎患者中呈高表達，并可能作為診斷肺炎的生物標志物，但miR-223-3p在肺炎發生過程中的作用機制尚未闡明[5]。miR-223-3p在肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞損傷中的作用機制，及其是否可作為天麻素減輕肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞損傷的作用靶點尚未可知。本研究采用肺炎鏈球菌誘導肺泡上皮細胞建立細胞損傷模型，探討了天麻素是否可通過調控miR-223-3p的表達而影響肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞增殖、凋亡及炎癥反應。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 天麻素購自昆明制藥；肺炎鏈球菌購自美國ATCC；肺泡上皮細胞A549購自中國科學院細胞庫；白細胞介素-10(IL-10)、IL-6檢測試劑盒購自上海酶聯生物；Trizol試劑、反轉錄、熒光定量PCR購自美國Theromo Fisher公司；Lipofectamine2000、MTT試劑(北京索萊寶公)司；凋亡檢測試劑盒(美國Sigma)；兔抗人B細胞淋巴瘤/白血病相關X蛋白(Bax)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體(美國Santa Cruz)；二抗(美國Abcam)；miR-223-3p寡核苷酸抑制物(miR-223-3p inhibitor)及陰性對照序列(anti-miR-NC)、miR-223-3p寡核苷酸模擬物(miR-223-3p mimic)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)均購自上海吉瑪。

1.2方法

1.2.1實驗分組：肺泡上皮細胞A549放入37℃水浴鍋中融化1 min后加入含10%胎牛血清的DMEM培養液3 ml重懸；將細胞接種于培養瓶中，待細胞生長密度達到90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶2的比例進行傳代培養。取對數生長期A549細胞4×105個/ml接種于96孔板，每孔100 μl，加入肺炎鏈球菌(1×108CFU/ml )培養細胞24 h[6]記為模型組。同時將正常培養的細胞作為對照組。分別加入不同濃度的天麻素(2.5、5.0、10.0 μmol/L)與肺炎鏈球(1×108CFU/ml )培養細胞24 h[7]，分別標記為天麻素2.5 μmol/L組、天麻素5.0 μmol/L組、天麻素10.0 μmol/L組。使用不含胎牛血清的細胞培養液與anti-miR-NC、miR-223-3p inhibitor混合后室溫孵育5 min(A液)，Lipofectamine2000轉染試劑與不含胎牛血清的細胞培養液充分混合(B液)；A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min，并將其加入A549細胞，轉染6 h棄上清液后更換正常培養液，并繼續培養48 h，隨后加入肺炎鏈球菌(1×108CFU/ml )培養細胞24 h，分別標記為anti-miR-NC組、miR-223-3p inhibitor組。采用上述轉染方法將miR-NC、miR-223-3p mimic轉染至A549細胞后加入含10.0 μmol/L天麻素與肺炎鏈球菌(1×108CFU/ml )培養細胞24 h，分別標記為天麻素10.0 μmol/L+miR-NC組、天麻素10.0 μmol/L+miR-223-3p mimic組。

1.2.2細胞增殖檢測：取各組A549細胞(4×105個/ml)接種于96孔板，每孔100 μl，于培養箱內繼續培養24 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，室溫避光孵育5 min后應用酶標儀檢測吸光度值(OD值)。

1.2.3細胞凋亡率檢測：各組A549細胞加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清，加入500 μl結合緩沖液重懸細胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫避光孵育10 min后，于1 h內應用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4細胞中miR-223-3p的表達檢測：以Trizol法提取各組A549細胞總RNA，反轉錄合成cDNA；按照qRT-PCR試劑盒配制反應體系，反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環40次。以羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測miR-223-3p相對表達水平。

1.2.5IL-10、IL-6檢測水平：取各組細胞培養上清液，采用ELISA法檢測IL-10、IL-6的水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.6Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達：采用蛋白提取試劑盒提取各組A549細胞總蛋白，取50 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳反應，轉膜、封閉，加入一抗稀釋液(1∶1000)后孵育過夜(4℃)，使用TBST洗滌后加入二抗稀釋液(1∶2000)，室溫孵育1 h后滴加ECL，暗室內曝光顯影后應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1細胞增殖、凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達比較 與對照組比較，模型組OD值、Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，凋亡率、Bax蛋白表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，天麻素5.0、10.0 μmol/L組OD值、Bcl-2蛋白水平升高，凋亡率和Bax蛋白水平顯著降低，且天麻素10.0 μmol/L組較天麻素5.0 μmol/L組上述指標變化更顯著，差異有統計學意義(P<0.01)；但天麻素2.5 μmol/L組與模型組OD值、凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、2和表1。

表1 5組A549細胞活性、凋亡率及Bax、Bcl-2表達水平比較

圖1 流式細胞儀檢測5組A549細胞凋亡情況

圖2 5組A549細胞凋亡蛋白表達免疫印跡圖

2.2肺泡上皮A549細胞中miR-223-3p表達及炎性因子水平比較 與對照組比較，模型組IL-6水平和miR-223-3p的表達水平顯著升高，IL-10顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，天麻素5.0、10.0 μmol/L組IL-6、miR-223-3p的表達水平降低，IL-10升高；且天麻素10.0 μmol/L組較天麻素5.0 μmol/L組上述指標變化更顯著，差異有統計學意義(P<0.01)。但天麻素2.5 μmol/L組與模型組IL-6、IL-10及miR-223-3p表達水平比較差異無統計學意義(P>0.01)。見表2。

表2 5組A549細胞中miR-223-3p表達及炎性因子水平比較

2.3抑制miR-223-3p對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞活性及凋亡的影響 與anti-miR-NC組和模型組比較，miR-223-3p inhibitor組OD值和Bcl-2蛋白表達水平升高，細胞凋亡率及Bax蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.01)。模型組與anti-miR-NC組OD值、細胞凋亡率和Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、4和表3。

表3 3組肺炎鏈球菌誘導的A549細胞活性、凋亡率及Bax、Bcl-2表達水平比較

圖3 流式細胞儀檢測抑制miR-223-3p對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡的影響

圖4 抑制miR-223-3p對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡蛋白免疫印跡圖

2.4抑制miR-223-3p對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞中炎性因子的影響 與anti-miR-NC組和模型組比較，miR-223-3p inhibitor組IL-10水平升高，IL-6水平降低(P<0.01)。見表4。

表4 3組肺炎鏈球菌誘導的A549細胞中炎性因子水平比較

2.5過表達miR-223-3p對天麻素處理肺炎鏈球菌誘導的A549細胞活性及凋亡影響 與天麻素10.0 μmol/L+miR-NC組進行比較，天麻素10.0 μmol/L+miR-223-3p mimic組OD值和Bcl-2蛋白表達水平降低，細胞凋亡率和Bax蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5、6和表5。

表5 過表達miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導的A549細胞活性、凋亡率及Bax、Bcl-2表達水平比較

圖5 流式細胞儀檢測過表達miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡的影響

2.6過表達miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導A549細胞炎性因子的影響 與天麻素10.0 μmol/L+miR-NC組比較，天麻素10.0 μmol/L+miR-223-3p mimic組IL-10水平降低，IL-6水平升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見表6。

表6 過表達miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導的A549中炎性因子水平比較

3 討論

肺炎是臨床常見的一種呼吸系統疾病，其發病率逐漸增高，肺炎的主要病原菌是肺炎鏈球菌[8]。肺炎鏈球菌感染后，肺泡上皮細胞凋亡率升高，從而使患者機體的抗感染能力降低[9]。絨毛大黃菌葉提取物、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、皮質紫荊顆粒等均可減輕肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞損傷[10]。天麻素對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞損傷的影響尚未闡明。

圖6 過表達miR-223-3p對天麻素處理的肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡蛋白免疫印跡圖

天麻素可減輕海馬神經元細胞損傷，并可降低缺氧缺糖誘導的星形膠質細胞氧化損傷及抑制細胞凋亡[11-12]。天麻素具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用，并可改善糖氧剝奪誘導的神經細胞損傷[13]。本研究結果顯示，肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞活力降低，凋亡率明顯升高，提示成功建立肺泡上皮細胞損傷模型。Bcl-2/Bax比值升高可促進細胞凋亡，而比值降低可抑制細胞凋亡[14]。本研究結果顯示，模型組Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低。提示天麻素可促進肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞的活力和增殖，并抑制細胞凋亡。IL-10屬于炎性抑制因子，高水平的IL-10可減輕肺損傷；IL-6屬于促炎因子，其水平升高可促進肺損傷[15]。本研究結果顯示，模型組IL-10水平降低，IL-6水平升高，而天麻素5.0、10.0 μmol/L組可明顯使IL-6水平降低，IL-10水平提高，提示天麻素可以抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞炎癥反應從而減輕炎性肺損傷。

miR-223-3p可通過調控炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α及TLR4/TLR2/NF-κB/STAT3信號通路而參與脂多糖誘導人脂肪干細胞的損傷過程[16]。miR-223-3p負調控NLRP3炎性小體參與肝損傷過程[17]。本研究結果顯示，模型組miR-223-3p表達水平升高，天麻素5.0、10.0 μmol/L組miR-223-3p表達水平降低。提示天麻素可通過下調miR-223-3p的表達發揮作用。本研究結果顯示，抑制miR-223-3p表達可提高肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞活力，降低細胞凋亡率；并可使IL-10升高，IL-6降低。提示抑制miR-223-3p表達可促進肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞增殖及抑制細胞凋亡。本研究結果顯示，miR-223-3p過表達可降低天麻素對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡，減輕炎癥反應。

綜上所述，天麻素可通過下調miR-223-3p的表達而促進肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞增殖及抑制細胞凋亡、炎癥反應，從而減輕肺泡上皮細胞損傷。miR-223-3p可能作為天麻素治療肺炎的潛在靶點，但關于其作用機制尚需進一步探究。