外泌體中circ_0044366調控腫瘤相關成纖維細胞MMP2的表達促進結直腸癌轉移的機制研究

馬維東，王彤彤，朱啟航，楊海鷗，林 丹

天津醫科大學腫瘤醫院胰腺腫瘤科，天津300060

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球癌癥死亡的主要原因之一，CRC發病年齡呈現年輕化趨勢［1］。多種危險因素（如遺傳因素、生活方式、飲食習慣和環境影響）均能誘發CRC的發生、發展［2］。盡管最近CRC治療（包括化療和放療）取得了進展，但是CRC的預后仍然相對較差［3］，導致CRC患者的生存率相對較低，目前死亡率為12%～87%［4］。轉移是CRC患者死亡的主要原因［5］，其中肝轉移約占這些死亡的60%［6-7］，因此與CRC轉移相關的分子生物標志物的鑒定對于CRC的后續治療和延長患者生存期至關重要。

外泌體是一種納米級的（30～100 nm）細胞外囊泡，可由大多數類型的細胞分泌，并在體液（如血液、尿液、唾液和母乳）中循環［8］。近年來，有研究［9］表明，外泌體在CRC的進展中作用廣泛。外泌體內容物廣泛，可包裹各種生長因子、蛋白質、脂質、核酸，以及環狀RNA（circular RNA，circRNA）、miRNA等非編碼RNA，并將其轉運到靶細胞中。circRNA是一種新型的具有共價閉環結構的內源性RNA［10］。在細胞中，circRNA不僅可以與miRNA或蛋白質結合以發揮各種功能［11］，而且可以與其他核酸、脂質和蛋白質一起被分選進入細胞外囊泡中。外泌體從細胞分泌到體液中，circRNA通過體液開始其循環并激活其生物學功能。

目前有多項研究［12-14］發現，circRNA作為miRNA分子海綿參與CRC細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等病理生理學過程，并且某些circRNA作為miRNA分子海綿與CRC放療敏感性有關。circ＿0055625通過吸附miR-106b-5p，抑制其發揮功能，間接激活ITGB8信號通路，從而促進CRC的進展［15］。還有研究［16］表明，circRAE1通過結合miR-338-3p影響TYRO3的表達，顯著促進CRC細胞的遷移和侵襲。因此，circRNA/miRNA/靶基因/靶蛋白軸可能是CRC發生的重要環節之一。基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）是一種具有Ⅳ型膠原降解特性的蛋白質［17］。本研究旨在探討CRC細胞分泌外泌體包裹的circ_0044366轉運至腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblast，CAF）中，通過吸附miR-29b對CRC侵襲及轉移的影響及其可能的作用機制，為尋找CRC侵襲和轉移的生物標志物提供有意義的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機抽取2018年1月—2019年12月就診于天津醫科大學腫瘤醫院的46例CRC患者血清樣本及同期收治的46例非癌癥人群（對照組）血清樣本（表1）。所有患者均經病理學檢查確診為CRC，且在取樣前未接受任何癌癥相關治療。

表1 46例CRC患者臨床病理學特征Tab.1 Clinicopathological features of 46 CRC patients［n (%)］

1.2 實驗材料

1.2.1 外周血清標本

所有血清樣本抽取均在清晨空腹條件下，收集血清于抗凝管中于4℃保存，并在2h內以1 900×g離心15 min。離心后取上清液于除酶1.5 mL Ependorf試管內并置于-80℃冰箱中保存。所有血清的采集均征得癌癥患者和非癌癥人群的知情同意，符合人體試驗委員會制定的倫理學標準并獲得天津醫科大學腫瘤醫院倫理委員會的認可。

1.2.2 組織標本

收集手術切除的CRC患者的腫瘤組織標本及配對癌旁標本共40對，其中男性24例，女性16例。所有標本的留存均獲得患者及其家屬的知情同意，符合人體試驗委員會制定的倫理學標準并獲得天津醫科大學腫瘤醫院倫理委員會的認可。

1.2.3 細胞系

CRC細胞系SW480、HCT116購自中國科學院分子細胞科學卓越創新中心。CRC組織來源的CAF和正常成纖維細胞（normal fibroblast，NF）從CRC患者的癌組織及癌旁組織中分離得到。

1.2.4 常規試劑和耗材

含有miR-29b結合區的熒光素酶報告質粒p-circ-MIR-29b由金斯瑞生物科技股份有限公司構建，含有circ_0044366過表達或circ_0044366 shRNA序列的慢病毒及質粒購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司，miR-29b mimics/inhibitor以及相應對照均由廣州銳博生物技術有限公司質控合成，抗MMP2抗體、抗CD63抗體、抗TSG101抗體、抗Alix抗體、抗GAPDH抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購自美國Santa Cruz公司，抗α-SMA抗體、抗FAP抗體、抗FSP1抗體均購自英國Abcam公司，TRIzol RNA提取試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）相關引物均由廣州銳博生物技術有限公司設計合成，PKH26膜染料試劑盒購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

SW480和HCT116細胞系均培養于RPMI-1640完全培養基中，CAF和NF細胞系培養于DMEM完全培養基中。細胞置于37℃、CO2體積分數為5%的恒溫、恒濕細胞培養箱中進行培養。

1.3.2 外泌體提取

將細胞培養液吸入離心管并按如下梯度離心：4 ℃條件下，1 000×g離心10 min，3 000×g離心30 min，10 000×g離心60 min，100 000×g離心70 min。從沉淀中收集外泌體并重懸于磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）中。提取的外泌體懸液可放置于4 ℃下保存3 d并盡快使用。

1.3.3 蛋白質印跡法（Western blot）

采用放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定實驗樣本蛋白濃度，定量后30 μg蛋白上樣十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉膜至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉常溫封閉1h，分別與抗MMP2抗體（1∶500）、抗CD63抗體（1∶2 000）、抗TSG101抗體（1∶1 000）、抗Alix抗體（1∶1 000）和抗GAPDH抗體（1∶3 000）在4 ℃下溫育過夜。過夜后用洗膜緩沖液（tris buffered saline Tween，TBST）洗膜。室溫下溫育相應二抗1 h，電化學發光（electrochemical luminescence，ECL）顯影曝光并采集實驗結果。

1.3.4 細胞轉染

將培養皿中細胞消化重懸后以適宜密度接種到6孔板中，細胞充分貼壁且融合度為60%～70%時按照LipofectamineTM2000轉染試劑（美國Invitrogen公司）說明書的步驟進行轉染，于培養箱內培養6 h后更換完全培養基繼續培養。

1.3.5 RNA提取及RTFQ-PCR

按廠家說明書使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）從培養的細胞和組織中提取總R N A，然后將RNA反轉錄獲得cDNA，采用SYBR Green Ⅰ RTFQ-PCR檢測各組細胞mi R-29 b和MMP2 mRNA的 表達水平。引物設計如下：MMP2上游引物為5’-AAGGCGTTAGTTCTTCGGGG-3’，下游引物為5’-CACCTTTTGCTCCACAGTGC-3’；circ_0044366上游引物為5’-GCTGG GGTGTGTTAAGCTTT-3’，下游引物為5’-ACCC ACGTGTCCTTAGAGAA-3’；GAPDH上游引物為5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s為1個循環，共35個循環；最后1個循環72 ℃延伸2 min，每組設3個復孔并重復3次。每組miR-29b和MMP2 mRNA的相對表達水平按公式2-ΔΔCt計算。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因實驗

將細胞接種于24孔板中，細胞貼壁后待轉染；將含有miR-29b潛在結合位點的MMP2 3’非翻譯區（3’-untranslated region，3’-UTR）的熒光素酶報告質粒及結合位點突變的熒光素酶報告質粒（1 μg/孔），與miR-29b mimics、miR-29b inhibitors（100 pmol/孔）分別進行共轉染，另分別各設1個對照組，總計6組；轉染4～6 h后換液為完全培養基再培養24 h；培養結束后，用熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega公司）檢測各組熒光素酶表達水平（依照說明書操作）；操作中的吸光度（D）值用酶標儀進行測量，以載體熒光素酶報告質粒催化底物產生的熒光活性作為參照，最終分析相對熒光活性。

1.3.7 免疫熒光實驗

將細胞懸液加入到24孔板中，待貼壁且密度合適時換用2%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的條件培養基，并向培養基中添加40 μL外泌體與細胞共培養，48 h后吸棄培養基并用PBS清洗細胞3次，向孔板內加入500 μL 4%多聚甲醛溶液固定細胞15 min，PBS清洗；用10%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液封閉2 h，取出封閉液，將按1∶250配制的一抗稀釋液加入24孔板中，4 ℃搖床溫育過夜；PBS洗滌后加入按1∶1 000配制的二抗稀釋液，室溫搖床溫育1 h；PBS洗滌后將用PBS按1∶1 000配制的Hochest稀釋液加入24孔板中，室溫溫育10 min；PBS洗滌后用抗淬滅劑封片于共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.8 免疫組織化學染色

將石蠟包埋切片脫蠟、水化，PBS洗2次，每次5 min，3%H2O2室溫封閉5～10 min，蒸餾水洗3次，每次5 min，然后進行抗原修復，PBS洗5 min，BSA室溫封閉20 min。滴加一抗于4 ℃下溫育過夜，PBS洗3次，每次2 min；滴加生物素化二抗，20～37 ℃下20 min，PBS洗3次，每次2 min，滴加試劑SABC，20～37 ℃下20 min，PBS洗4次，每次5 min，然后進行DAB顯色試劑盒顯色；蒸餾水洗3次，每次5 min，然后使用蘇木精復染2 min、鹽酸乙醇分化；脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3.9 PKH26染色

本研究采用PKH26膜染料試劑盒染色外泌體膜，用于觀察與追蹤外泌體能夠成功進入受體細胞中。將按超速離心法提取的外泌體沉淀用100 μL Diluent C試劑充分重懸（A液）；另取100 μL Diluent C試劑，向其中加入0.4 μL PKH26染料，充分混勻（B液）；用移液器將A液與B液充分混合，于室溫下共同溫育15 min后向其中加入200 μL血清，并在室溫下共同溫育1 min以中止染色；用PBS清洗上述外泌體1次，后加入適量新PBS重懸備用。

1.3.10 裸小鼠荷瘤模型的建立

將BALB/c裸小鼠（6～8周齡）隨機分組并標記，將SW480細胞、穩定過表達circ_0044366（circ_0044366-overexpression，circ_0044366-O E）的SW480細胞及敲低circ_0044366（circ_0044366-knockdown，circ_0044366-KD）的SW480細胞充分擴增，分別將上述細胞系的單細胞懸液（每只裸小鼠1×107細胞）以皮下注射的方式接種到裸小鼠中，與未移植瘤裸小鼠共計4組飼養在無病原體的動物設施中，可隨意進食。定期觀察裸小鼠狀態并記錄皮下成瘤生長情況。在移植瘤后的第48天處死裸小鼠，并取裸小鼠肝臟，計數肝臟轉移瘤個數。

1.4 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，各組實驗數據采用表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC血清外泌體中circRNA的鑒定

使用超速離心法從CRC患者和非癌癥人群中分離出的血清外泌體，在透射電子顯微鏡下顯示為膜性囊泡狀結構，中央凹陷，直徑約為100 nm（圖1A）。接下來檢測外泌體的特異性表面蛋白TSG101、Alix和CD63，詳見圖1B。綜上可知，細胞培養液經超速離心法得到的顆粒符合外泌體所報道的重要特征，可確認成功分離外泌體，可進行后續實驗。經測序發現1組外泌體circRNA在CRC患者血清外泌體中與非癌癥人群血清外泌體中的表達具有高度差異性（圖1C），CRC組中95個circRNA顯著上調（倍數變化＞4），94個circRNA明顯下調（變化倍數＜0.25），其中CRC組外泌體中的Has_circ_0044366比非癌癥人群組高124倍，后續研究主要圍繞circ_0044366展開。RTFQ-PCR結果顯示，circ_0044366在正常人外泌體中表達較低，而在CRC患者血清外泌體中高表達（P＜0.05，圖1D）。

圖1 CRC血清外泌體中circRNA的鑒定Fig.1 Identification of circRNA in serum exosomes of CRC

2.2 建立轉染SW480外泌體的CAF細胞系

腫瘤微環境由多種細胞類型組成，其中CAF占間質細胞的比例最大。分離腫瘤組織中的CAF和癌旁組織中的NF，免疫熒光實驗顯示，CAF組α-SMA、FAP和FSP1各項指標均明顯高于NF組（圖2A）。將SW480細胞外泌體與CAF細胞共溫育，并采用PKH26對外泌體進行染色標記并進行追蹤，PKH26標記的SW480細胞外泌體成功進入受體細胞CAF中（圖2B），并且在透射電子顯微下觀察到SW480細胞外泌體（SW480 exosomes，480 exos）（圖2C）。接下來檢測CAF、SW480和HCT116細胞系的外泌體中circ_0044366的表達水平。RTFQ-PCR結果顯示，480 exos和HCT116來源外泌體（HCT116 exosomes，116 exos）中circ_0044366高表達，而在CAF來源外泌體組（CAF exosomes，CAF exos）中circ_0044366顯著低表達（P＜0.05，圖2D）。選取circ_0044366表達最高的SW480細胞系，分別用0.9%NaCl溶液（saline）、480 exos、circ_0044366敲低的SW480細胞外泌體（circ_0044366-deleteSW480 exosomes，480 exos circ_0044366 del）與CAF共培養后進行RTFQ-PCR，結果顯示，saline組及480 exos circ_0044366 del組中circ_0044366含量均較低，而480 exos組circ_0044366含量明顯升高（P＜0.05，圖2E）。

圖2 建立轉染SW480外泌體的CAF細胞系Fig.2 Establishment of CAF cell line transfected with 480 exos

2.3 circ_0044366與miR-29b直接相互作用

通過生信分析確定了circ_0044366與miR-29b之間存在的兩個靶點（圖3A）。經TargetScan數據庫（http://www.targetscan.org/）、DAⅤID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）交叉驗證miR-29b具有調控MMP2表達的潛在作用，預測了在MMP2 mRNA中miR-29b的3’-UTR結合區（圖3B）。免疫組織化學分析表明，在CRC組織中MMP2高表達，而在癌旁組織中低表達（P＜0.05，圖3C）。接下來進一步鑒定CRC細胞外泌體circ_0044366與MMP2蛋白之間的臨床相關性：用RTFQ-PCR測定外泌體中的circ_0044366表達水平，用Western blot和灰度分析相結合的方法對MMP2蛋白進行定量，結果顯示，在CRC血清外泌體中circ_0044366的表達水平與MMP2蛋白的表達水平呈正相關（P＜0.05，圖3D）。用同樣的方法測定MMP2 mRNA的表達水平和MMP2的表達水平，兩者無顯著相關性（P＞0.05，圖3E），因此推測circ_0044366通過轉錄后途徑調控MMP2的表達。

圖3 circ_0044366與miR-29b的直接相互作用Fig.3 Direct interaction of circ_0044366 with miR-29b

2.4 circ_0044366和MMP2可靶向結合miR-29b

雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，過表達miR-29b可以顯著抑制circ_0044366和MMP2 mRNA 3’-UTR野生型質粒的熒光強度（P＜0.05），而對circ_0044366和MMP2 mRNA 3’-UTR突變型質粒的熒光強度無明顯抑制作用（P＞0.05，圖4A、B）。抑制miR-29b可以顯著促進circ_0044366和MMP2 mRNA 3’-UTR野生型質粒的熒光強度（P＜0.05），但對circ_0044366和MMP2 3’-UTR突變型質粒的熒光強度無明顯促進作用（P＞0.05），證明circ_0044366靶向結合miR-29b，而miR-29b對MMP2 mRNA的3’-UTR區進行轉錄后調控。Western blot結果顯示，與480 exos共培養的CAF細胞中MMP2蛋白的表達水平升高，而與480 exos circ_0044366 del共培養的CAF中MMP2的表達水平降低（圖4C），證明480 exos介導的circ_0044366可以增強CAF中MMP2蛋白的表達水平。向CAF細胞中轉染miR-29b mimics抑制了MMP2蛋白的表達，而轉染miR-29b inhibitors則促進了MMP2的表達（圖4D、F），但對MMP2的mRNA水平無明顯影響（P＞0.05，圖4E），證明miR-29b可以通過轉錄后途徑抑制MMP2蛋白的表達水平。接下來在CAF細胞中進行了細胞功能回復實驗，結果顯示，circ_0044366-OE組MMP2蛋白的表達水平顯著升高且可被miR-29b mimics逆轉，circ_0044366-KD組MMP2蛋白的表達水平顯著降低且可被miR-29b inhibitors逆轉（圖4H），但對MMP2的mRNA水平無明顯影響（P＞0.05，圖4G）。

圖4 circ_0044366靶向調控miR-29b，miR-29b靶向調控下游的MMP2Fig.4 circ_0044366 regulated miR-29b,which targeted downstream MMP2

2.5 體內實驗驗證circ_0044366促進腫瘤生長

為進一步評估circ_0044366對體內腫瘤生長的影響，本研究建立了裸小鼠移植瘤模型，共計4組（圖5A），培養期間每隔8 d測量各組裸小鼠荷瘤的直徑（圖5B）。此外，分別提取4組裸小鼠的血清外泌體（圖5C），RTFQ-PCR結果顯示，circ_0044366-KD組中血清外泌體circ_0044366含量降低，而在circ_0044366-OE組中顯著增多（圖5D）。同時，circ_0044366-KD組瘤體中circ_0044366含量及MMP2蛋白的表達水平降低，而circ_0044366-OE組瘤體中circ_0044366含量及MMP2蛋白的表達水平顯著升高（圖5E、G），兩組中MMP2的mRNA水平無明顯差異（圖5F）。

圖5 體內實驗證實circ_0044366與miR-29b及MMP2的相互作用Fig.5 In vivo experiments confirmed the interaction of circ_0044366 with miR-29b and MMP2

2.6 體內轉移模型驗證下調circ_0044366抑制腫瘤的侵襲和轉移

同時，本研究對裸小鼠移植瘤模型進行手術取出完整的肝組織，分別計數肝內轉移瘤的個數。其中，circ_0044366-OE組裸小鼠全部出現肝臟轉移（6/6），平均轉移瘤為5.5個，數量顯著多于對照組，而circ_0044366-KD組中出現肝臟轉移的裸小鼠模型僅占本組總數的33.3%（2/6），平均轉移瘤為1.5個，顯著少于對照組，證明敲低circ_0044366能夠顯著減少CRC肝轉移的發生（圖6）。

圖6 體內轉移模型驗證circ_0044366對腫瘤侵襲和轉移的作用Fig.6 In vivo metastasis model verifies the effect of circ_0044366 on tumor invasion and metastasis

綜上，本研究通過一系列實驗，從體內外均證明了CRC細胞中circ_0044366能夠通過外泌體轉運至CAF細胞中，通過吸附miR-29b上調MMP2的表達水平，進而促進CRC細胞的侵襲和轉移。該跨細胞信號通路包括circ_0044366、miR-29b及MMP2及其相互之間的聯系，在調節CRC細胞的侵襲和轉移中的發揮重要作用（圖7）。

圖7 circ_0044366調控CAFMMP2釋放并促進CRC進展的機制模型Fig.7 Mechanism model of circ_0044366 regulating MMP2 release from fibroblasts and promoting CRC progression A proposed model illustrating the role of CAF-derived exosomal circ_0044366 in regulating ferroptosis in CAF and promoting CRC invasion and metestasis

3 討論

circRNA是一種非編碼RNA，其對核酸外切酶介導的降解具有抗性，是穩定的環狀結構，并且在各種細胞類型中普遍表達［18］。這些circRNA通常用作競爭性內源RNA來影響下游miRNA的功能［19］。研究［20］表明，circRNA在外泌體中富集和穩定，可以在循環血液和尿液中檢測到。外泌體可以被包括巨噬細胞在內的許多類型的細胞所接受，還可以充當細胞間的信使，細胞可以通過外泌體來轉移circRNA。

隨著微陣列和RNA測序技術的顯著進步，已發現越來越多的circRNA在眾多疾病過程中起著至關重要的作用，尤其是在包括CRC在內的癌癥。有研究［21］證明，circIFT80促進上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），在circIFT80過表達的情況下，CRC細胞的侵襲和遷移顯著增加，與E-鈣黏著蛋白表達下降以及波形蛋白和N-鈣黏著蛋白表達增加有關。一項針對食管鱗狀細胞癌的研究［13］表明，cir-ITCH對miRNA具有吸附作用，提高cir-ITCH水平會促進腫瘤的進展。也有越來越多的證據表明，外泌體circRNA在CRC的腫瘤生長［9-10］、免疫逃逸［27］、血管生成［22］、轉移［23］和耐藥性形成［24］中發揮關鍵作用。從血液樣本中收集的外泌體已顯示出在疾病早期的診斷潛力，TNM階段特異性的預后潛力以及對CRC中常見的化療藥物和聯合用藥即5-FU和FOLFOX的預測潛力，且已經證明外泌體circRNA比單獨的癌胚抗原和糖類抗原19-9具有更高的敏感性和特異性［25］。

本研究探索了circ_0044366在CRC侵襲和轉移中的作用，并證明在CRC患者血清外泌體中circ_0044366的含量顯著高于正常血清外泌體。通過熒光素酶報告基因試驗證實，circ_0044366靶向結合miR-29b，且miR-29b與MMP2蛋白的表達水平明顯相關。本研究首先發現外泌體介導的circ_0044366能夠促進CRC細胞的遷移，通過外泌體進行跨細胞通訊，顯著促進CRC細胞的侵襲和轉移。

MMP2存在于細胞外基質中，是一種具有Ⅳ型膠原降解特性的蛋白質，其催化位點中含有3個纖維連接蛋白Ⅱ型重復序列，使變性Ⅳ型膠原和Ⅴ型膠原與彈性蛋白結合。研究［26-29］表明，MMP2的表達與CRC、肺癌、甲狀腺乳頭狀癌、成神經細胞瘤、膀胱癌等多種癌癥進展相關。

綜上，本研究表明，敲低CRC細胞中的circ_0044366有望通過調控miR-29b/MMP2軸來抑制CRC的侵襲和轉移，為探尋診治CRC轉移的生物標志物提供了有意義的實驗依據，也為治療轉移性CRC提供了新的跨細胞通訊調控思路，開啟了新的研究角度，其在轉移性CRC的生物標志物診斷、預后判斷以及從抑制轉移的角度延長患者生存期和提高患者生存質量方面均具有重要意義。