83例多發肺腺癌患者的臨床病理學特征分析

彭子珊，孔 輝，鮑 真，趙紅杏，劉 鑫，盧韶華

復旦大學附屬中山醫院病理科，上海 200032

肺癌是惡性程度較高的腫瘤之一，每年因肺癌死亡人數約1 600萬人［1］。作為一種特殊類型的肺癌，多發肺癌（multifocal lung cancer，MLC）的發生率為1%～15%［2］。MLC又可分為多原發肺腺癌（multiple primary lung adenocarcinoma，MPLA）和肺內轉移（intrapulmonary metastases，IM），而MPLA和IM的鑒別，對腫瘤分期及治療有重要意義。1975年，Martini等［3］首次提出MPLA的鑒別標準。隨后，Antakli等［4］在1995年提出了修訂過的Martini-Melamed標準。美國胸科醫師學會在2007年為Martini-Melamed標準增加了臨床評估和分子分析［5］。本研究回顧性分析83例多發肺腺癌（multifocal lung adenocarcinoma，MLA）患者的臨床病理學特征，根據病理形態學特征及基因突變情況來鑒別MPLA及IM，以提高臨床和病理科醫師對MPLA和IM的認識水平。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2016年1月—2017年12月復旦大學附屬中山醫院收治的83例MLA患者進行分析。入組患者均有完整的臨床病例資料，包括性別、年齡、吸煙史、手術方式、腫瘤數目、腫瘤位置、腫瘤最大徑及生存情況等。TNM分期參考標準為美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版肺癌TNM分期，MLA位于同一肺葉時為T3期，MLA位于同側肺但不同肺葉時為T4期，MLA位于對側肺葉時為M1a期。隨訪數據通過查閱病歷系統、電話聯系等方式獲得。

1.2 MLA雙原發與轉移的鑒別

1.2.1 病理學分析

所有H-E切片均由兩名獨立的病理科醫師閱片，對肺腺癌亞型（貼壁型、腺泡型、乳頭型、實體型及微乳頭型等）進行獨立評分，所占比例最大的亞型認為是主要亞型［6］。根據同一患者的不同腫瘤在石蠟切片上的形態學表現，參考Martini-Melamed標準，若多個病灶均觀察到“貼壁型”到肺腺癌浸潤的發展過程，則為MPLA；若無，且主要組織學亞型、次要組織學亞型均相似者判斷為IM，主要組織學亞型、次要組織學亞型差異較大者判斷為MPLA［7-8］。若有爭議，則兩名醫師共同討論或專家會診后判定。

1.2.2 基因分析

所有患者均行9基因檢測，具體包括表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因第18、19、20、21外顯子突變、KRAS基因第2外顯子突變、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因融合、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）基因第20外顯子突變、NRAS基因第2、3外顯子突變、BRAF基因第15外顯子突變、ROS1基因融合、RET基因融合、PIK3CA基因第9、20外顯子突變的檢測。若兩病灶存在1個及1個以上相同的基因突變，考慮為IM；若兩病灶存在1個及1個以上不同的基因突變，則考慮為MPLA［9］。當形態學結論與基因分析結果不一致時，以基因分析結果為準；當兩病灶均無基因突變時，采用組織學分析結果［8，10］。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 臨床病理學特征

83例患者中，男性33例，女性50例。發病年齡為34～80歲，中位年齡（64.0±8.6）歲。68例患者為雙病灶，14例患者為三病灶，1例患者為四病灶。62例患者有吸煙史。37例患者病灶位于同一肺葉，27例患者病灶位于同側不同肺葉，19例患者病灶位于對側肺葉。所有腫瘤均經手術切除且均為同時切除（表1）。

表1 83例MLA患者的臨床病理學特征Tab.1 The clinicopathological features of 83 MLA patients［n (%)］

2.2 MPLA和IM的鑒別診斷

83例MLA患者根據病理形態學特征，50例（60.00%）判斷為MPLA，33例（40.00%）為IM。在50例MPLA中，23例（46.00%）主要組織學亞型及次要組織學亞型差異較大，27例（54.00%）患者的多個病灶均觀察到“貼壁型”到肺腺癌浸潤的發展過程。1例MLA患者的兩個病灶的組織學亞型均以篩狀型為主（圖1A、B），主要組織學亞型相似，因此組織學判斷為IM；另1例MLA患者的一個病灶以乳頭型及微乳頭型為主（圖1C），另一病灶以貼壁型為主，部分為腺泡型（圖1D），主要組織學亞型及次要組織學亞型差異較大，因此組織學判斷為MPLA。

圖1 MPLA和IM患者的組織學形態Fig.1 Histological classification of MPLAs and IM patients

基因突變分析結果顯示，83例MLA患者的182個病灶中，118個（68.84%）病灶檢測出EGFR基因突變，15個（8.24%）病灶檢測出KRAS基因突變，7個（3.85%）病灶檢測出ALK基因突變，4個（2.20%）病灶檢測出PIK3CA基因突變，3個（1.65%）病灶檢測出HER2基因突變，2個（1.10%）病灶檢測出BRAF基因突變，1個（0.55%）病灶檢測出ROS1基因突變，1個（0.55%）病灶檢測出RET基因突變，未檢出NRAS基因突變。39例（46.99%）患者的多個病灶均有1個及1個以上相同的基因突變，因此鑒別為IM；其中多個病灶均發生EGFR第18外顯子突變為1例，均發生EGFR第19外顯子突變為12例，均發生EGFR第20外顯子突變為2例，均發生EGFR第21外顯子突變為21例，均發生KRAS基因第2外顯子突變為1例，均發生ALK基因融合為1例，均發生HER2基因第20外顯子突變為1例。35例（42.17%）患者的多個病灶存在1個及1個以上不同的基因突變，因此鑒別為MPLA。例如，1例66歲女性MLA患者，病灶1檢測出KRAS基因第2外顯子突變，病灶2檢測出EGFR第19外顯子突變，基因突變不相同，因此鑒別為MPLA。9例（10.84%）患者未檢測出任何基因突變，鑒別結果以病理形態學分析結果為準。此外，18例（21.69%）患者的病理形態學分析結果與基因分析結果不一致，最終診斷以基因分析結果為準（表2）。其中6例患者形態學判斷為IM，但病灶間存在一個以上差異的基因突變，因此結合基因分析結果判斷為MPLA；其中2例病灶位于同一肺葉，3例病灶位于同側不同肺葉，1例病灶位于對側肺葉，并且2例出現復發。12例患者形態學判斷為MPLA，但病灶間存在一個以上相同的基因突變，因此結合基因分析結果判斷為IM；其中2例病灶位于同一肺葉，7例病灶位于同側不同肺葉，3例病灶位于對側肺葉，并且3例患者死亡，5例出現復發。結合病理形態學分析結果及基因突變分析結果，最終判斷41例（49.00%）為MPLA，42例（51.00%）為IM。

表2 18例病理形態學和基因突變結果不一致的MLA患者的病理學和遺傳學信息Tab.2 Pathologic and genetic information of 18 cases of discordant patients according to histological and gene mutation results

2.3 預后分析

83例患者的末次隨訪時間為2021年2月，中位隨訪時間為46個月。至末次隨訪時，22例出現復發轉移，10例死亡，3年OS率為93.98%，3年DFS率為77.11%。MPLA組中，5例出現復發轉移，2例死亡，3年OS率為95.12%，3年DFS率為87.80%。IM組中，17例出現復發轉移，8例死亡，3年OS率為80.95%，3年DFS率為59.52%。

本研究分別比較了病理形態學判斷和結合基因分析判斷兩種情形下MPLA和IM的生存差異。在病理形態學判斷的結果中，IM組患者OS率（圖2A）和DFS率（圖2B）均低于MPLA組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結合基因分析后，MPLA和IM組間患者OS率差異無統計學意義（P＞0.05，圖2C），但DFS率差異有統計學意義（P=0.003，圖2D），鑒別為IM的患者DFS率更差。根據淋巴結是否轉移分組時，在N0及Nx狀態下，IM組患者DFS率更差（P=0.016），OS率亦低于MPLA組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；在N1及N2狀態下，IM和MPLA組間患者OS率無明顯差異，IM組患者的DFS率更差，但差異無統計學意義（P＞0.05，圖3）。對OS率和DFS率的單因素分析結果表明，男性（P=0.009）、淋巴血管侵犯（P=0.011）及EGFR野生型（P＜0.001）是OS率的危險因素，淋巴管/血管侵犯（P=0.005）及綜合標準鑒別為IM（P=0.004）是DFS率的危險因素（表3）。對OS率和DFS率的多因素分析結果表明，EGFR野生型（P=0.007）是OS率的獨立危險因素，綜合標準鑒別為IM（P=0.007）是DFS率的獨立危險因素（表4）。此外，病理形態學分析在單因素和多因素分析中對患者OS率和DFS率的影響差異均無統計學意義（P＞0.05），表明病理形態學是鑒別診斷MPLA和IM的重要手段，基因檢測可作為重要的補充鑒別手段。

圖2 病理形態學鑒別MPLA和IM的OS率（A）、DFS率（B）生存曲線圖，病理形態學結合基因突變分析鑒別MPLA和IM的OS率（C）、DFS率（D）生存曲線圖Fig.2 OS rate (A) and DFS rate (B) curves of patients with MPLA and IM diagnosed by histological analysis,OS rate (C) and DFS rate (D)curves of patients with MPLA and IM diagnosed by histological and gene mutation analysis

圖3 綜合鑒別MLC患者N0和Nx狀態下MPLA和IM的OS率（A）、DFS率（B）生存曲線圖，以及N1和N2狀態下MPLA和IM的OS率（C）、DFS率（D）生存曲線圖Fig.3 OS rate (A) and DFS rate (B) curves of N0 and Nx patients and OS rate (C) and DFS rate (D) curves of N1 and N2 patients with MPLA and IM diagnosed by histological and gene mutation analysis

表3 影響83例MLA患者預后的單因素分析Tab.3 Univariate analyses of prognostic factors in 83 MLA patients

續表 3

表4 影響83例MLA患者預后的多因素分析Tab.4 Multivariate analyses of prognostic factors in 83 MLA patients

3 討論

1975年，Martini等［3］首次提出根據腫瘤部位及組織學類型來診斷MPLA的診斷標準。Martini-Melamed標準至今仍然被廣泛使用，隨后亦有多次修訂，著重增加了腫瘤分子遺傳學特征，同時兼顧多原發和轉移的鑒別診斷［4-5，11］。但目前為止尚無明確的MPLA和IM的鑒別診斷標準。

Girard等［7］研究發現，全面的病理組織學分類分析方法可有效地鑒別診斷MPLA和IM。Sun等［12］研究發現，病灶含貼壁成分通常鑒別為原發病灶，該研究利用貼壁成分及全面的病理組織學分類對54例患者的116個病灶進行鑒別，發現多原發組的患者預后較好，表明差異較大的組織學亞型、貼壁成分為鑒別MPLA和IM的可靠依據。近年來，隨著分子生物學技術的廣泛應用，比較基因組雜交、微衛星分析及二代測序等在MLC的鑒別中發揮著重要作用。有研究［13］將具有相似分子生物學特征的病灶鑒別為IM，差異較大者鑒別為MPLA。Chang等［14］采用EGFR、TP53突變分析對58例多發非小細胞肺癌患者鑒別MPLA和IM，結果顯示，28例為MPLA，22例為IM，8例無法鑒別。此外，Girard等［15］通過分析EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA和TP53的突變狀態也有助于鑒別MPLA和IM。但采用多種方法鑒別MPLA和IM時，研究者發現部分病例基因分析與病理形態學分析結果存在差異。Murphy等［16］使用Martini-Melamed標準、二代測序對37例MPLA患者的76個病灶進行分析，其中有9例組織學診斷結果與二代測序基因分析結果差異明顯。Chang等［8］利用病理組織學評估、二代測序進行MLC的鑒別，發現22%的病理組織學評估和二代測序結果不一致。此外，Nicholson等［17］闡述了綜合病理學分析對MLA的鑒別意義，包括病理學亞型、細胞大小、核分裂象及壞死等。但眾多研究一致發現，病理學形態判讀具有主觀性，即使資深的病理專科醫師，病理學判讀結果仍存在不一致性。而基因分析在MLC的鑒別中同樣具有局限性，如原發性腫瘤和轉移性腫瘤間存在異質性，病灶之間突變的相似性，并不表明確定的克隆關系［8］。上述研究表明，鑒別診斷MPLA和IM，需結合病理形態學及基因分析進行綜合判斷。本研究的83例患者中9例未檢測出任何基因突變，鑒別結果以病理形態學分析結果為準；18例患者的病理形態學分析結果與基因分析結果存在差異，最終診斷以基因分析結果為準。

在預后分析中，本研究通過比較單獨病理形態學判斷和結合基因分析判斷的兩種情形下MPLA和IM患者的生存差異，進而比較兩種方法對預后的指導意義。結果發現，若單獨通過病理形態學判斷，MPLA和IM組間OS率和DFS率差異無統計學意義，但結合基因分析后，MPLA和IM組間DFS率差異有統計學意義。此外，COX危險因素分析顯示，單獨病理形態學鑒別MPLA和IM并非OS率和DFS率的危險因素，但結合基因分析綜合鑒別MPLA和IM是患者DFS率的獨立危險因素，提示基因檢測可作為兩者鑒別的輔助方法以提高診斷效率，且對患者預后具有指導意義。

文獻［8-9，14，18-25］提示，MLC中MPLA的比例為36%～88%，IM的比例為12%～64%。本研究依據病理組織學分析結果，60%的患者鑒別為MPLA，40%為IM。結合基因分析后，49%的患者鑒別為MPLA，51%為IM，與以往研究中的比例類似。此外，IM與多個病灶內均有微乳頭成分［8］、KRAS野生型［6］、淋巴結轉移［6，23］、吸煙［6，8，23］、腫瘤位置［6，9］等密切相關。多數研究［18，22，25-26］發現，MLC中診斷為IM的患者預后更差；但少數研究［6，27］發現，IM和MPLA的鑒別診斷對患者預后無顯著影響。本研究結果顯示，IM和MPLA的鑒別診斷對患者的OS率無顯著影響，但對患者的DFS率影響顯著。MLA患者若診斷為IM，術后更易發生復發轉移。且若無淋巴結轉移，IM患者更易出現復發，表明MPLA和IM的鑒別診斷在無淋巴結轉移的患者中尤為重要。此外，對OS率和DFS率進行單因素和多因素分析發現，綜合標準鑒別MPLA和IM與患者的OS率無關，但為DFS率的獨立危險因素。綜上，MLA患者術后準確檢測EGFR狀態對患者的OS率非常重要，綜合病理組織學分析結果及基因分析結果鑒別診斷MPLA和IM對患者的DFS率非常重要。

隨著高分辨計算機斷層掃描（high-resolution computed tomography，HRCT）的普及，多發磨玻璃影（ground-glass opacity，GGO）結節的檢出率逐步提高［28］。研究［29-30］發現，HRCT表現為GGO的MLC病灶轉移傾向很小。Hattori等［31］報道，在多發GGO結節的患者中，未切除的＜10 mm的純GGO結節對患者的OS率無顯著影響，定期隨訪即可。然而，Li等［32］通過對多發GGO結節進行二代測序發現，肺內的純GGO結節也會發生轉移。具有部分實性成分的GGO結節由于侵襲性更強，因此不論大小，均應選擇手術切除［33］。Hattori等［34］報道，在MLC患者中，所有病灶均為實性結節、病灶同時有實性結節和混合GGO結節與病灶均為純GGO結節相比，5年OS率差異有統計學意義，其中所有病灶均為實性結節的患者預后最差，病灶均為純GGO預后最好。此外，無淋巴結轉移的多發GGO結節患者，亞肺葉切除術的5年OS率與肺葉切除術差異無統計學意義［31］。

目前，MLC的鑒別診斷方法有多種，包括病理形態學分析、克隆分析、多個基因組合檢測熱點基因突變、全外顯子測序及全基因組測序，但由于部分分子檢測費用較大，目前尚不能普及應用，因此病理組織學特征仍是鑒別診斷MPLA和IM的重要手段，分子檢測可作為鑒別的輔助方法以提高診斷準確率。本研究預后分析顯示，診斷為IM的MLA患者術后復發風險更高，需定期復查和及時治療。綜上，MPLA和IM的鑒別診斷具有重要的臨床意義，仍需要探索更可靠的鑒別診斷方法，為臨床精準治療及預后判斷提供可靠依據。