紫花苜蓿形態和生理指標響應干旱脅迫的品種特異性

臧真鳳，白婕，劉叢，昝看卓，龍明秀，何樹斌

（西北農林科技大學草原與草業學院，陜西楊凌712100）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種產量高、營養價值豐富、適口性好、消化率高、經濟價值高并且抗逆性較強的豆科牧草，素有“牧草之王”的美譽［1-2］。近些年來，在國家振興奶業苜蓿發展行動及“糧改飼”等產業政策的帶動下，我國紫花苜蓿種植面積增長速度較快。據不完全統計，僅2019年全國新增苜蓿種植面積8×1014m2，主要集中在我國西北地區的甘肅河西走廊、內蒙古阿魯科爾沁、寧夏河套灌區等［3］。水資源短缺是限制紫花苜蓿生長和分布的最重要因素之一［4］。研究表明，干旱脅迫下，紫花苜蓿含水量降低［5］、葉綠素含量減少［6］、光合氣體交換能力下降［7-8］、碳（carbon，C）、氮（nitrogen，N）代謝活性降低［9］、產量和營養價值減少［10］。為了適應干旱脅迫，紫花苜蓿通常會調整植物形態學特征、生物量分配和器官C/N計量特征模式［11-12］，啟動滲透調節和抗氧化機制等提高其自身抗旱性［13-14］。

植物在適應環境變化的規律方面存在一定的特異性［13］。研究表明，紫花苜蓿響應干旱脅迫的生物量分配策略、滲透調節能力和抗氧化酶機制等都具有品種特異性規律［15］，也就是說不同紫花苜蓿品種對干旱脅迫的響應在形態學和生理學方面存在差異。然而，在生產中有關苜蓿品種特異性的研究相對較少。根系是紫花苜蓿獲取營養、貯藏物質和感知土壤中的水分狀態的主要器官［16-17］，在適應干旱脅迫的過程中發揮著重要作用。有關紫花苜蓿適應干旱脅迫的品種特異性研究多側重于地上部分，而對葉片和根系協同響應干旱脅迫的品種特異性研究相對較少。因此，本研究選用我國北方地區紫花苜蓿生產中推廣范圍較廣的WL 363HQ和巨能7紫花苜蓿品種，在溫室內模擬干旱脅迫，通過分析株高、分枝數、生物量、葉片和根系中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脯氨酸、抗氧化酶類物質、C、N、C/N、穩定性C同位素（δ13C）和穩定性N同位素（δ15N）等，旨在明確供試品種在葉片和根系水平上響應干旱脅迫的形態和抗逆生理方面的品種特異性規律。研究結果將為進一步掌握紫花苜蓿葉片和根系協同抗旱機制及抗旱豐產紫花苜蓿新品種的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設計

供試紫花苜蓿品種WL 363HQ和巨能7來源于北京克勞沃種業有限公司。試驗于2020年4-9月在西北農林科技大學草業與草原學院智能溫室中完成。選取大小均勻、顆粒飽滿健康的紫花苜蓿種子，用75%酒精溶液浸泡消毒5 min，蒸餾水沖洗5～6次后，放入裝有濾紙的培養皿中，浸潤后置于溫度25℃/18℃（白天/黑夜），14 h/10 h（光/暗）、相對濕度60%的恒溫培養箱中。發芽7 d后，選取生長均一且完整的幼苗移栽到裝有1.5 kg取自田間耕作層土壤的花盆中（盆口直徑為12 cm，底直徑為7 cm，高為19 cm）。每花盆移栽一株植物，裝盆前土壤預先過篩，土壤主要營養成分如下：C（13.5 g·kg-1）、全N（1.26 g·kg-1）、全磷（0.8 g·kg-1）、有效鉀（8.29 mg·kg-1）、鈣（92.85 mg·kg-1）、鈉（138.39 mg·kg-1）。移栽80 d后，選取健康、長勢均一的植株采用稱重法進行干旱脅迫。試驗設正常水分70%±5%（對照）和干旱脅迫35%±5%（干旱）兩個水分梯度。通過稱重法每隔2 d用蒸餾水補充植物蒸騰失去的水分，使其處于不同的水分梯度下。本試驗共有4個處理，每個處理20盆植物，共計80盆紫花苜蓿。干旱脅迫處理28 d后，分別采集紫花苜蓿的葉片和根系測定各項指標。

1.2 試驗指標與方法

用直尺測定紫花苜蓿從莖基部到植株頂端的株高，并在莖基部計數其分枝數；將收獲的紫花苜蓿沖洗干凈后，再用吸水紙擦去多余水分，分別稱取地上部分和根系的鮮重，再將其置于105℃的烘箱中殺青10 min，之后在80℃將植物烘干至恒重后稱取干重，將植物的地下部分干重與其地上部分干重相比獲得根冠比；采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量［18］；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量［19］；采用氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［20］；采用愈創木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性［21］。葉片和根系C、N含量及δ13C和δ15N在中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所分析測試中心采用ATC-185穩定性同位素質譜儀測定；C/N為植物組織中全C、N含量的質量比。

1.3 數據分析

利用Excel軟件對數據進行整理，所有數據均為3次重復的平均值。使用SPSS 25.0軟件對數據進行雙因素方差分析（two-way ANOVA），并利用Origin 2020b進行作圖。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對2個供試品種生長指標的影響

干旱脅迫下，WL 363HQ和巨能7之間的株高差異顯著（P＜0.05）（圖1）。干旱脅迫顯著降低了巨能7的株高（P＜0.05），但WL 363HQ的株高在干旱脅迫下與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。WL 363HQ和巨能7分枝數之間對干旱脅迫的響應不同，與對照相比，干旱脅迫處理下WL 363HQ的分枝數顯著降低（P＜0.05），而巨能7分枝數差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7的株高和分枝數Fig.1 Plant height and br anch number of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought str ess

在對照和干旱脅迫下，WL 363HQ地上部分鮮重和干重均高于巨能7（表1）。相比對照，巨能7地上部分的鮮重和干重在干旱脅迫下顯著降低（P＜0.05）。WL 363HQ根系干重和鮮重在干旱脅迫處理下顯著降低（P＜0.05），但巨能7根系鮮重和干重與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。巨能7品種的根冠比在干旱脅迫下顯著增加（P＜0.05），而WL 363HQ的根冠比在干旱脅迫下減小，但差異不顯著（P＞0.05）。

表1 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7的生物量分配規律Table 1 Biomass allocation of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

2.2 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系MDA含量的影響

在對照和干旱脅迫下，WL 363HQ葉片和根系中的MDA含量均高于巨能7，且根系中MDA含量均高于葉片。干旱脅迫顯著提高巨能7葉片中MDA的含量34.30%（P＜0.05），也顯著增加WL 363HQ根系中的MDA含量24.50%（P＜0.05）（圖2）。

圖2 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的MDA含量Fig.2 MDA content in leaf and root of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

2.3 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系中脯氨酸含量的影響

WL 363HQ和巨能7葉片和根系中脯氨酸的含量在干旱脅迫下均有增加，尤其是干旱脅迫顯著提高WL 363HQ葉片中脯氨酸的含量（P＜0.05），比對照提高了69.95%；干旱脅迫也顯著提高巨能7根系中脯氨酸的含量（P＜0.05），比對照提高了120.78%，且巨能7根系中的脯氨酸含量均高于WL363HQ根系脯氨酸的含量（圖3）。

圖3 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的脯氨酸含量Fig.3 Free proline content in leaf and root of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

2.4 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系中SOD和POD活性的影響

在干旱脅迫下，WL363HQ根系中SOD活性顯著高于巨能7根系中SOD活性（P＜0.05）（圖4）。與對照相比，WL 363HQ和巨能7葉片中SOD活性在干旱脅迫時分別增加了21.52%和72.16%，且差異顯著（P＜0.05）。WL 363HQ根系中SOD活性在干旱脅迫下顯著增加（P＜0.05），與對照相比增加了75.64%；而干旱脅迫下根系中POD的活性與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。干旱脅迫顯著提高了巨能7根系中POD活性（P＜0.05），比對照提高了135.74%。在對照和干旱脅迫下，葉片中SOD和POD活性分別高于根系中SOD和POD的活性。

圖4 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的SOD和POD活性Fig.4 SOD and POD activity in leaf and root of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

2.5 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系中C和N含量的影響

在對照處理下，WL 363HQ和巨能7之間的C含量差異不顯著（P＞0.05）（圖5）。干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系的C、N含量，與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。對照處理下，WL 363HQ和巨能7葉片之間C/N差異不顯著（P＞0.05），而在根系中，WL 363HQ的C/N顯著高于巨能7（P＜0.05）。干旱脅迫顯著增加巨能7葉片和根系中C/N（P＜0.05），而WL 363HQ紫花苜蓿葉片和根系內C/N在干旱脅迫下差異不顯著（P＞0.05）。

圖5 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的C和N含量Fig.5 Carbon and nitr ogen content in leaf and r oot of WL 363HQ and M agnumⅦunder dr ought str ess

2.6 干旱脅迫對2個供試品種葉片和根系中δ13C和δ15N的影響

在對照和干旱脅迫下，WL363HQ和巨能7葉片δ13C差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。干旱脅迫顯著增加了巨能7葉片內的δ13C（P＜0.05），干旱脅迫也顯著增加了WL 363HQ和巨能7根系中δ13C（P＜0.05），分別比對照提高了8.85%和4.61%。在對照和干旱脅迫下，WL363HQ和巨能7葉片中的δ15N差異顯著（P＜0.05），并且WL363HQ葉片δ15N顯著高于巨能7（P＜0.05），而WL363HQ和巨能7根系內的δ15N差異不顯著（P＞0.05）。WL 363HQ和巨能7葉片和根系中δ15N均受干旱脅迫而下降，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 干旱脅迫下WL 363HQ和巨能7葉片和根系中的δ13C和δ15NFig.6δ13C andδ15N values in leaf and root of WL 363HQ and MagnumⅦunder drought stress

3 討論

紫花苜蓿調整生物量分配策略是其適應干旱脅迫的重要機制之一［22］紫花苜蓿地上生物量和根系生物量，這個結果與其他有關紫花苜蓿干旱脅迫的研究結果一致［7，23］。干旱脅迫下紫花苜蓿氣孔關閉［8］，光合氣體交換能力下降，葉面積縮小［7］是其生物量降低的主要原因之一。紫花苜蓿分枝數與其生物量大小相關，是抗旱評價的重要指標之一［24］。WL 363HQ和巨能7紫花苜蓿分枝數在干旱脅迫下顯著減少，這與其他研究結果也一致［25-26］。本研究中WL 363HQ和巨能7根系生物量對干旱脅迫的響應較為明顯，這與干旱脅迫對紫花苜蓿根系生物量的影響較小的研究結論相反［22］，這說明紫花苜蓿根系對干旱脅迫的響應受供試紫花苜蓿品種、脅迫程度和處理時間等因素的影響［7］。干旱脅迫下多年生草本植物向根系分配更多的生物量，增加其根冠比，以獲取更多限制性的營養物質，這是其適應干旱脅迫的重要機制之一［12］。本研究中干旱脅迫增加了巨能7的根冠比，但降低了WL 363HQ的根冠比，這意味著植物在適應環境變化的規律方面存在一定的特異性［13］，不同紫花苜蓿品種在響應干旱脅迫的生物量分配策略等方面具有品種特異性［15］。

MDA是植物細胞膜系被氧化的產物，是植物受到逆境脅迫的標志［27］。滲透調節和抗氧化酶清除機制是紫花苜蓿適應干旱脅迫的重要機制，可調節植物細胞的水勢，減小干旱對細胞的影響［10］。本研究中，干旱脅迫下供試品種葉片和根系MDA和脯氨酸含量及抗氧化酶活性較對照均升高，這與國內外其他相關研究的結果是一致的［7，15，28］。然而，供試品種的葉片和根系MDA和脯氨酸的含量及抗氧化酶類物質的活性，在器官水平也具有品種特異性規律，這可能是葉片和根系所處的地上和地下環境的差異，導致其物理、化學屬性以及在時間和空間上資源獲取策略的不同形成的［29］。WL363HQ葉片MDA含量相對較少，說明光合同化器官受到干旱損傷相對較低，且葉片和根系對干旱脅迫具有相對較強的滲透調節和抗氧化協同機制，推測這可能是WL363HQ在對照和干旱脅迫下生物量相對較高的重要原因，也說明滲透調節機制和活性氧清除機制是紫花苜蓿在抗旱脅迫下的重要響應機制［7］。

紫花苜蓿葉片和根系中C、N代謝對干旱脅迫的響應較為敏感，干旱脅迫往往降低了紫花苜蓿葉片和根系中C、N代謝［9］。本研究中干旱脅迫并沒有顯著降低供試品種葉片和根系中C、N含量，這可能是由于豆科牧草中根系貯藏的C、N營養物質較多，干旱脅迫下貯藏的營養物質發生轉運，調整了C、N營養物質的同化和需求能力［30］。此外，不同研究中選取的紫花苜蓿品種、固氮菌屬性、干旱脅迫時間等不同都會導致研究結果之間的差異。盡管植物體內N濃度在一定程度上決定了生物量大小，本研究中干旱脅迫下供試品種N含量雖然沒有顯著變化，但生物量卻顯著減低，這是由于紫花苜蓿在干旱脅迫下的生長不僅取決于N的吸收，而且取決于N在器官中的分配規律及結構組織和光合組織中的分布策略等［23］。盡管干旱脅迫對供試品種葉片和根系C、N含量沒有顯著影響，但干旱脅迫顯著增加了WL363HQ和巨能7紫花苜蓿根系的δ13C。這可能是因為干旱脅迫降低了紫花苜蓿的氣孔導度，限制了CO2向羧化位點的供應［31］，降低了C同位素的分餾，增加了光合同化產物中的13C的比例，且這部分增加的光合產物通過木質部轉運到了根系［32］。干旱脅迫降低了土壤N的有效性，紫花苜蓿更加依賴生物固氮獲取N［33］，這是干旱脅迫下兩個供試品種根系δ15N均降低的重要原因之一。此外，本研究中WL 363HQ葉片和根系的δ15N均顯著高于巨能7，說明WL 363HQ紫花苜蓿的N代謝活性較高，即使在干旱脅迫下也能維持較高N代謝及N轉運的效率［34］，這也是WL 363HQ在干旱脅迫下生物量較高的另外一個重要原因。然而植物的δ15N受到土壤硝化、植物吸收特性（如時間和吸收類型）和微生物侵染率等的影響［34］，有關紫花苜蓿不同組織δ15N響應水分脅迫的深層次的原因還需深入研究。根系C/N的變化是植物適應環境的重要信號調節機制［35］，反映了植物C、N營養物質的吸收及轉運策略［36］。值得注意的是，本研究中干旱脅迫僅增加了巨能7紫花苜蓿的C/N，這說明紫花苜蓿生物量的分配模式、營養物質的濃度與其根系C/N計量關系存在一定的聯系，植物采用適應性策略，調整器官C/N，優化了生理防御與生長發育之間的協同關系［37］。本研究中干旱脅迫下供試品種C、N代謝參數并沒有在葉片和根系水平上表現出較為明顯的品種特異性規律，深層次的機制還有待進一步探討。

4 結論

干旱脅迫下紫花苜蓿WL 363HQ和巨能7的株高和根冠比都具有品種特異性的規律；干旱脅迫下供試品種的葉片和根系MDA和脯氨酸的含量及抗氧化酶的活性在器官水平也具有品種特異性規律。干旱脅迫增加了WL 363HQ和巨能7根系的δ13C，提高了巨能7葉片和根系的C/N，但是C、N代謝參數并沒有在葉片和根系水平上表現出較為一致的品種特異性規律。在對照和干旱脅迫下，WL 363HQ相比巨能7具有相對較高的生物量，其葉片和根系也具有相對較強的滲透調節和抗氧化協同能力及相對較高的N代謝活性（δ15N）。